緑膿菌によって産生されるモノラムノリピッドおよびジラムノリピッドの検出と定量

要約

緑膿菌はラムノリピッドバイオサーファクタントを産生します。薄層クロマトグラフィーは、各菌株によって産生されるモノラムノ脂質とジラムノリピッドの割合を検出し、決定します。総ラムノリピドの定量には、培養上清から抽出されたこれらのバイオサーファクタントに存在するラムノース当量をオルシノール法を用いて評価することが含まれます。

要約

環境細菌 Pseudomonas aeruginosa は、健康被害を表す高い抗生物質耐性を持つ日和見病原体です。この細菌は、ラムノリピッド(RL)として知られるバイオサーファクタントを高レベルで生成しますが、これはバイオテクノロジー上の大きな価値を持つ分子ですが、病原性形質にも関連しています。この点で、RLの検出と定量は、バイオテクノロジーアプリケーションと生物医学研究プロジェクトの両方に役立つ可能性があります。本稿では、 緑膿菌 が産生する2種類の液性RLの産生を、単鎖脂質(mRL)という1つのラムノース部分に結合した脂肪酸(主にC10-C10)の二量体で構成する分子と、2つのラムノース結合体に結合した類似の脂肪酸二量体で構成する分子であるジラムノリピッド(dRL)の産生を、薄膜クロマトグラフィー(TLC)を用いて検出する手法を段階的に示します。さらに、 緑膿菌 培養上清から抽出したこれらのバイオサーファクタントの酸加水分解と、その後のオルシノールと反応するラムノースの濃度の検出に基づいて、RLの総量を測定する方法を紹介します。両方の手法の組み合わせを使用して、PAO1(系統群1)、PA14(系統群2)、およびPA7(系統群3)のタイプ株でここで例示されるように、特定の株によって産生されるmRLおよびdRLのおおよその濃度を推定することができます。

概要

緑膿菌は環境細菌であり、病原性に関連する形質の産生と高い抗生物質耐性により、非常に懸念される日和見病原体です^1,2。この細菌によって産生される特徴的な二次代謝産物はバイオサーファクタントRLであり、これは酸化還元活性を持つ抗生物質であるフェナジンピオシアニンやプロテアーゼエラスターゼ³など、いくつかの病原性関連形質と協調して産生されます。RLの張力活性および乳化特性は、さまざまな産業用途で利用されており、現在商品化されています⁴。

ほとんどの緑膿菌株は、系統群1および2に属し、主に10個の炭素からなる脂肪酸二量体に結合した1つのラムノース部分からなるmRLと、最初のラムノース⁴に結合した追加のラムノース部分を含むdRLの2種類のRLを産生します(図1を参照)。しかし、緑膿菌の2つのマイナーな系統群(グループ3および5)は、mRL5,6のみを産生することが報告されています

プロトコル

この手順は 、補足図 1 に図示されています。本試験に使用した試薬および機器は、 資料表に記載されています。

1. TLCを用いた緑膿菌の培養上清中のmRLおよびdRLの検出

1. 目的の 緑膿菌 株の遠心分離したブロスから始め、液体培地で24時間培養します(RLが産生される成長の固定段階に到達するため)。通常、これらの培養物には、1 mLあたり1 x 10⁹ 個の細菌が含まれています。
2. 濃縮HClを使用して、培養物のpHを2に調整します。
3. 50 mLのポリプロピレンチューブに5 mLの酸性化培養上清を入れ、5 mLの2:1クロロホルム:メタノール混合物を加えます。
4. チューブを3回、毎回10秒間反転させて攪拌し、各攪拌の間に2分間反転せずにチューブを放置します。
5. 2つの相が分離するまでチューブを約3時間攪拌せずに放置するか、チューブを3,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。
6. 有機相(最下層)をきれいなチューブに移し、乾燥するまでチューブを抽出フードに入れておきます。
7. ステップ1.3からこの....

ディスカッション

RLを検出および定量するための最も正確な方法は、質量分析(^MS)と組み合わせたHPLCです^7,8,27;ただし、多くの研究者がアクセスできない可能性のある専門的で高価な機器が必要です。ここで説明する方法は、基本的な実験室の材料や機器を使用してRL濃度を検出および推定するために日常的に実行できますが、いくつかの制?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C