超短自己組織化ペプチドマトリックス中のSW1222細胞株由来結腸直腸癌オルガノイドの作製とキャラクタリゼーション

要約

このプロトコールは、免疫染色による細胞接着、オルガノイド形態、および遺伝子発現のための生体機能的自己組織化ペプチドを評価することを目的としています。結腸直腸癌細胞株を使用して、集中的なテストのためのオルガノイドを取得する費用対効果の高い方法を提供します。

要約

超短自己組織化ペプチド(SAP)は、細胞外マトリックスに似たナノファイバーを自発的に形成することができます。これらの繊維は、生体適合性、生分解性、および非免疫原性のハイドロゲルの形成を可能にします。私たちは以前に、SAPがタンパク質由来のモチーフで生物官能基化されると、結腸直腸オルガノイド形成をサポートする細胞外マトリックス特性を模倣できることを証明しました。これらの生体機能ペプチドハイドロゲルは、元の親ペプチドの機械的特性、調整性、および印刷適性を保持しながら、細胞とマトリックスの相互作用を可能にして細胞接着を増加させる手がかりを組み込んでいます。この論文では、結腸直腸がんオルガノイドを費用対効果の高い方法で形成できる腺がんがん細胞株を使用して、細胞接着と内腔形成に対するさまざまな生体機能ペプチドハイドロゲルの効果を評価および特徴付けるために必要なプロトコルを示します。これらのプロトコルは、免疫染色および蛍光画像解析を使用して、細胞接着および管腔形成に対する生体機能ペプチドハイドロゲルの影響を評価するのに役立ちます。この研究で使用した細胞株は、以前に動物由来のマトリックス中のオルガノイドの生成に利用されています。

概要

近年、自己組織化ペプチド(SAP)は、組織工学用途の有望な生体材料として浮上しています。SAPは、ナノファイバーの自然形成、生体適合性、生分解性、非免疫原性などのユニークな特性を有しており、足場開発の有力な候補となっています¹。SAPはこれまで様々な種類の細胞と併用されてきましたが、特に報告されている超短SAPは、幹細胞のカプセル化を促進しながら、30種類以上の継代を網羅し、染色体異常の発生を最小限に抑えながら、幹細胞の多能性を維持しています^2,3,4。したがって、オルガノイド培養での使用にSAPを適応させることは、合理的な次のステップを構成しました。

オルガノイドは、単一の多能性細胞から生じる複雑な三次元構造です。これらの構造は、さまざまな細胞タイプを生じさせ、その後、自己組織化して、in vitroでの胚成長および組織成長の発生過程を再現します⁵。この革新的なフレームワークは、in vivo 臓器に特徴的な遺伝的、表現型、および行動的特性を効率的に保存しながら、in vitro 研究のための強力な....

プロトコル

1. バッファーと溶液の調製

注:記載されているすべての濃度は最終濃度です。

1. ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン-ストレプトマイシンをそれぞれ10%と1%の最終濃度で添加し、完全なイスコーブ改変ダルベッコ培地(IMDM)を調製します。4°Cの暗所で最大1か月間保管してください。
2. リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)にMgCl₂ (3 mM)、スクロース(300 mM)、Triton X-100(0.5%)を混合して、透過化緩衝液を調製します。この溶液は4°Cで最大2か月間保存します。
3. ウシ血清アルブミン(BSA、1%)、グリシン(0.3 M)、およびTween-20(0.1%)をPBS中に組み合わせて、ブロッキングバッファーを調製します。この溶液は4°Cで最大2か月間保存します。
4. 滅菌条件下で超純水でPBSを10倍から2倍に希釈します。この溶液は室温で6か月以上保存してください。
5. 3mgのペプチド粉末を紫外線下で30分間滅菌します。500μLの超純水を加え、ボルテックスミキサーで溶解します。
   注:最終濃度は目標濃度の2倍、つまり6 mg / mLである必要があります。1x濃度は3 mg / mLになります。

2. ペプチド中のSW1222から....

ディスカッション

生物医学研究におけるSAPの大きな可能性は、バイオファンクチャリゼーションによる順応性と適応性によって強調されています。このように広範な順列が存在するため、特にオルガノイド研究において、特定のアプリケーションで最も有望な構成を効率的に試験し、決定するという課題が生じます。迅速で費用対効果の高いソリューションが最も重要です。SW1222細胞株は、ヒト結腸直腸腺が?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015