ラット大腿骨の皮質骨における箱腔欠損モデルの作成

要約

ここでは、ラット大腿骨骨幹組織に箱腔欠損を作成するためのプロトコルを示します。このモデルは、生体力学的ストレス下での生体材料の性能を評価し、膜内骨形成に関連する骨再生のメカニズムを探ることができます。

要約

重度の骨欠損や複雑な骨折は、癒合不全や骨治癒の不十分さなどの重篤な合併症を引き起こす可能性があります。細胞、スキャフォールド、サイトカインを応用する組織工学は、骨再生の有望な解決策と考えられています。その結果、骨欠損をシミュレートするさまざまな動物モデルは、骨治癒のための組織工学の治療可能性を探求する上で重要な役割を果たします。本研究では、ラットの大腿骨中部に箱型の皮質骨欠損モデルを確立し、生体材料の骨治癒促進機能を評価するための理想的なモデルとなることが期待されます。この箱型の皮質骨欠損を口腔低速ハンドピースを用いて穿孔し、旋盤針で成形した。術後マイクロCT分析が直ちに実施され、箱腔皮質骨欠損の確立が成功したことを確認しました。その後、ラットの手術側の大腿骨を、手術後の複数の時点(0日後、2週間後、4週間後、6週間後)に採取しました。各サンプルの欠損領域の治癒過程は、マイクロCT、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、およびマッソントリクローム染色を使用して評価されました。これらの結果は、膜内骨化と一致する治癒パターンを示し、治癒は基本的に6週間で完了しました。この動物モデルの治癒過程を分類することで、骨組織欠損治癒中の膜内骨化を標的とする新規生体材料や薬剤をin vivo で研究するための効果的な方法が得られます。

概要

骨折や骨の欠損は、多くの場合、外傷、腫瘍、炎症、および先天性奇形に起因します^1,2。若年健常者の骨組織は通常、強固な再生能力を持っています^が3、臨界サイズを超える欠損や全身性疾患(糖尿病、骨粗鬆症、感染症など)による治癒障害は、骨の不連続性や治癒障害などの合併症を引き起こす可能性があります⁴。この臨床上の課題に対処するために、骨移植または生体材料は、重度に欠損した骨の置換や大きな骨セグメントの再建に一般的に使用されます。ただし、これらの治療法には制限があります。例えば、ゴールドスタンダードと考えられているにもかかわらず、自家骨移植はドナーの供給が制限され、ドナー部位の合併症の可能性に悩まされています^5,6。同種移植片はまた、免疫介在性拒絶反応、疾患の潜在的な伝染、移植片⁷の生体力学的および生物学的特性への悪影響など、特定のリスクも提示します。

近年、骨欠損の治癒メカニズムに着目した研究が盛んに行われています。代替生体材料の使用と組織工学の進歩は、骨再生の領域内で重要なトピックとして浮上しています

プロトコル

この研究のすべての動物手順は、四川大学西中国口腔病学学校の倫理委員会(WCHSIRB-D-2021-597)によってレビューされ、承認されました。本研究では、Sprague-Dawleyラット(雄、体重300g)を使用しました。

1. 術前準備

1. 機器の準備
   1. この研究で使用された手術器具については、 図 1A を参照してください: 電気シェーバー、組織ハサミ、眼科用ハサミ、眼用鉗子、使い捨てメス、骨膜セパレーター、経口低速ハンドピース、経口プローブ、使い捨て灌漑用真空、ニードルホルダー、3.0 縫合糸。
   2. 経口プローブを準備し、欠陥の直径に応じてマーカーペンでプローブの大きな湾曲した端に印を付けます(図1B)。これを使用して、手術中の欠陥のサイズを決定します。
   3. 使用前に、手順を実行するために使用したすべての手術材料と器具を滅菌してください。折りたたんだ布または包装紙に目的の材料を詰め、オートクレーブテープで密封して蒸気滅菌します(125〜135°Cで20〜25分間)。
   4. 手術領域の準備:75%アルコールを噴霧して、手術台と手術台周辺の環境を消毒します。手術台の上にオートクレーブドドで約60cm×90cmの無菌領域を作成します。
<....

ディスカッション

前臨床動物モデルは、骨の治癒と生体材料が骨再生に及ぼす影響を調べるために不可欠です。このプロトコルは、臨床骨再生に関連する膜内骨形成プロセスを再現する大腿骨箱腔欠損モデルを示しています。欠陥領域は、事前にマークされた経口プローブを使用して術中に標準化されました。マイクロCTおよび病理組織学的染色の結果は、骨膜の肥厚と新しい海綿骨の形成、続いて密集した?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mm slow speed ball drill	Dreybird Medical Equipment Co., Ltd.	RA3-012	For preparation of box cavity defects
3.0 suture	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For suturing wounds
4% paraformaldehyde	Biosharp	BL539A	For fix the femoral specimens
Cotton balls	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	20120047	For skin sterilization and cleaning of surgical field
Cotton sticks	Lakong Medical Devices Co., Ltd.	M6500R	For skin disinfection
Dental technician grinding machine	Marathon	N3-140232	For preparation of box cavity defects
Disposable scalpel	Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.	20100227	For creating skin incisions as well as to sharply separate muscle tissue
Electric shaver	JASE	BM320210	Removal of hair tissue from the surgical area
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	C1005	For the histological analysis of the specimens
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340	For the histological analysis of the specimens
Micro CT	Scanco medical ag	µCT 45	For analyzing the healing of defects in femoral samples
Needle holder	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For suture-holding needles
Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200	Chengdu Knowledge Technology Co.	VS200	For analyzing the results of HE staining and Masson staining
Ophthalmic forceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For clamping skin, muscle tissue
Ophthalmic scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For forming a skin incision approach
Oral low-speed handpiece	Marathon	Y221101003	For preparation of box cavity defects
Oral probe	Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd.	20000143	For measuring the diameter of defects
Periosteal separator	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For blunt separation of muscle tissue
Sprague–Dawley rats	Byrness Weil Biotech Ltd	None	For the establishment of femoral bone boxy cavitary defect
Tissue scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	None	For forming a skin incision approach