Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

要約

ここでは、 シロイヌナズナの細菌侵入に対する気孔応答の直接観察と自動測定のための簡単な方法を紹介します。この方法では、ポータブル気孔イメージングデバイスと、デバイスによってキャプチャされた葉の画像用に設計された画像解析パイプラインを活用します。

要約

気孔は、植物の葉の表皮に見られる微細な気孔です。気孔開口部の調節は、光合成のための二酸化炭素の取り込みと水分損失のバランスをとるだけでなく、細菌の侵入を制限するためにも極めて重要です。植物は微生物を認識すると気孔を閉じますが、病原菌、 Pseudomonas syringae pv. トマト DC3000(Pto)、閉じた気孔を再度開いて、葉の内部にアクセスします。細菌の侵入に対する気孔の反応を評価するための従来のアッセイでは、葉の表皮の皮、葉のディスク、または剥離した葉を細菌懸濁液に浮かせ、気孔を顕微鏡で観察した後、気孔の開口部を手動で測定します。しかし、これらのアッセイは煩雑であり、植物に付着した葉の自然な細菌侵入に対する気孔反応を反映していない可能性があります。最近では、葉を植物から切り離さずにつまんで気孔を観察できる携帯型イメージングデバイスや、撮影した葉の画像から気孔の開口を自動計測するディープラーニングによる画像解析パイプラインを開発しました。ここでは、これらの技術的進歩に基づいて、 シロイヌナズ ナの細菌侵入に対する気孔応答を評価する新しい方法を紹介します。この手法は、自然感染過程を模倣した Pto の噴霧接種、携帯型イメージングデバイスを用いた Pto接種植物の葉上の気孔の直接観察、画像解析パイプラインによる気孔開口の自動測定の3つの簡単なステップで構成されています。この方法は、自然な植物と細菌の相互作用を厳密に模倣した条件下で、 PTO 浸潤中の気孔の閉鎖と再開を実証するために成功裏に使用されました。

概要

気孔は、植物の葉やその他の地上部の表面にある一対のガードセルに囲まれた微細な気孔です。絶え間なく変化する環境下では、植物が光合成に必要な二酸化炭素の取り込みを制御し、蒸散による水分の損失を犠牲にして、気孔開口部の調節が中心となります。このように、気孔開口の定量化は、植物の環境適応を理解するのに役立っています。しかし、気孔の開口を定量化することは、顕微鏡で撮影した葉の画像から気孔孔を見つけて測定するのに人手がかかるため、本質的に時間と煩雑さがあります。これらの制限を回避するために、気孔生物学の研究に広く使用されているモデル植物であるシロイヌナズナの気孔開口の定量化を容易にするためのさまざまな方法が開発されています1,2,3,4,5,6。例えば、気孔コンダクタンスの指標として蒸散速度を測定するために、ポロメーターを使用することができる。ただし、この方法では、気孔コンダクタンスを決定する気孔数と開口部に関する直接的な情報は得られません。いくつかの研究では、蛍光アクチンマーカー、蛍光色素、または細胞壁自家蛍光を使用して気孔孔を強調....

プロトコル

1.植物を育てる

1. 休眠状態を打破するには、 A. thaliana (Col-0)の種子を脱イオン水に再懸濁し、暗所で4°Cで4日間インキュベートします。
2. 土に種を蒔き、白色蛍光灯を備えたチャンバーで育てます。生育条件は、温度22°C、光強度6,000ルクス(約100μmol/^m2/s)を10時間、相対湿度60%に維持してください。
3. 必要に応じて、液体肥料で植物に水をやります。接種の1週間前から2日前までは水やりを控え、接種の1日前に井戸に水をやりましょう。

2.細菌接種の準備

1. 固化したKing's B(KB)培地(20 gのトリプトン、1.5 gのK₂HPO_4、および15 gのグリセロール、1 L、1.5%寒天)上のグリセロールストックから50 μg/mLのリファンピシンでストリークPtoを採取し、28°Cで2日間インキュベートします。
2. 50 μg/mLのリファンピシンを5 mLのKB液体培地にシングルコロニーを接種し、28°Cで200 rpmで振とうしながら、対数増殖期が遅くなるまでインキュベートします。
3. 培養液を6,000 x g で2分間遠心分離し、上清....

結果

Ptoの噴霧接種後、接種した植物に付着した葉の気孔を携帯型気孔イメージング装置で直接観察した。手動および自動測定を使用して、同じ葉の画像を使用して、約60気孔の幅と長さの比率を取ることにより、気孔の開口部を計算しました。手動および自動測定では、接種後1時間(hpi)で模擬接種した植物と比較して、Pto接種植物の気孔開口部の減少が一貫して示され(

ディスカッション

以前の研究では、表皮の皮、葉の円盤、または剥離した葉を使用して、細菌の侵入に対する気孔の反応を調査しました^9,11,12。これに対し、本研究で提案する手法は、携帯型気孔イメージング装置を用いて、Ptoを噴霧接種した後、植物に付着した葉の気孔を直接観察し、細菌の侵入の自然条件を模倣するものです。?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron