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  • 要約
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  • プロトコル
  • 代表的な結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

mScarletと呼ばれる蛍光タンパク質を使用したEponの埋め込み後相関光および電子顕微鏡の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、蛍光と超微細構造を同時に維持できます。この技術は、さまざまな生物学的用途に適しています。

要約

光電子相関顕微鏡(CLEM)は、蛍光顕微鏡(FM)によって得られる局在情報と、電子顕微鏡(EM)によって取得された細胞の微細構造のコンテキストを組み合わせた包括的な顕微鏡です。CLEMは蛍光と超微細構造のトレードオフであり、通常、超微細構造は蛍光を損ないます。メタクリル酸グリシジル、HM20、K4Mなどの他の親水性包埋樹脂と比較して、エポンは超微細構造の保存と切断特性に優れています。以前、mEosEMが四酸化オスミウムの固定とエポンの包埋に耐えられることを実証しました。mEosEMを用いて、蛍光と超微細構造を同時に維持するEpon post embedd CLEMを世界で初めて実現しました。ここでは、EMサンプルの調製、FMイメージング、EMイメージング、および画像アライメントについて、ステップバイステップで詳しく説明します。また、EMイメージング中にFMイメージングで画像化された同じ細胞を識別する手順を改善し、FM画像とEM画像間のレジストレーションを詳細に説明します。私たちは、従来のEM施設でこの新しいプロトコルに従って、Epon post埋め込み相関光および電子顕微鏡を簡単に実現できると信じています。

概要

蛍光顕微鏡(FM)を使用して、標的タンパク質の局在と分布を得ることができます。しかし、標的タンパク質を取り巻くコンテキストが失われているため、標的タンパク質を徹底的に調べるためには非常に重要です。電子顕微鏡(EM)は、イメージング分解能が最も高く、細胞内の詳細をいくつか提供します。それにもかかわらず、EMにはターゲットラベリングがありません。FMで撮影した蛍光画像とEMで取得した灰色画像を正確に合成することにより、相関光電子顕微鏡(CLEM)は、これら2つのイメージングモード1,2,3,4で得られた情報を組み合わせることができます。

CLEMは、蛍光と超微細構造1のトレードオフである。現在の蛍光タンパク質と従来のEMサンプル調製手順、特にオスミン酸(OsO4)やEponなどの疎水性樹脂の使用には限界があるため、超微細構造は常に蛍光を損ないます5。OsO4 は、EM画像のコントラストを改善するために使用されるEMサンプル調製に不可欠な試薬です。他の包埋樹脂と比較して、エポンは超微細構造の....

プロトコル

動物の飼育と実験は、福建医科大学医療センターの施設動物管理および使用委員会によって承認されました。現在のプロトコルのステップバイステップのワークフローを 図1に示します。

1. サンプル調製

  1. マウス脳
    1. トランスジェニックマウス( 材料表を参照)およびオリゴヌクレオチドプライマー( 材料表を参照)を購入して、これらのマウスを遺伝子型決定します。
    2. 以前に公開されたプロトコル12,13に従って、無傷の脳を頭蓋ボールトから灌流して除去します。
    3. 10 mLの固定液( 材料表を参照)を用いて、4°Cで一晩マウスの脳を固定します。
    4. 固定液を0.1 Mリン酸緩衝液(PB)で3 x 10分間洗い流します。
    5. 振動するミクロトームを用いて、マウスの脳を厚さ500μmの切片にスライスします( 材料表を参照)。
    6. 実体顕微鏡を用いてメスで蛍光領域を小さな塊に切断する( 材料表参照)。

代表的な結果

以前の報告では、mScarletがリソソーム15を標的にできることが実証されました。このプロトコルでは、mScarlet(rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA)を発現するAAVを、Vglut2-ires-creマウス脳のM1(ML:±1.2 AP:+1.3 DV:-1.5)に定位固定装置を使用して注入しました。上述したプロトコルに従って、最終的な相関画像を図4Aに示す。FM画像は、金ナノ粒子(緑色の点)を基準?.......

ディスカッション

ここで紹介するプロトコールは、光学顕微鏡(LM)からの標的タンパク質の局在情報と、電子顕微鏡(EM)からの標的タンパク質を取り巻く状況を組み合わせることができる汎用性の高いイメージング方法です6。現在の蛍光タンパク質には限界があるため、広く使用されている方法は、EMサンプル調製の前にLMイメージングが行われることを意味する、相関光電子顕微鏡(CLEM)の事前.......

開示事項

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

謝辞

このプロジェクトは、中国国家自然科学基金会(Zhifei Fu 32201235)、中国福建省自然科学基金会(2022J01287 to Zhifei Fu)、福建医科大学先端人材研究財団(Zhifei Fu XRCZX2021013)、中国福建省金融特別科学基金会(22SCZZX002 to Zhifei Fu)、 NHC重点実験室、非ヒト霊長類の生殖能力調節技術評価、福建省母子保健病院(2022-NHP-04からZhifei Fu)の設立。福建医科大学公共技術サービスセンターのLinying Zhou氏、Minxia Wu氏、Xi Lin氏、Yan Hu氏には、EMサンプル調製とEMイメージングのサポートに感謝します。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 M Phosphate Buffer (PB)NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)Shanghai yuanye Bio-TechnologyR26284
25% Glutaraldehyde (GA)Alfa AesarA17876Hazardous chemical
Abbelight 3DNanolnsights
AcetoneSCR10000418
Ammonium hydroxideJ&K Scientific335213
BioPhotometer D30eppendorf
Cleaning buffer of cover glasses50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O
CoverglassWarner64-0715
DABCO Sigma290734Hazardous chemical
DDSASPI companyGS02827Hazardous chemical
Desktop centrifugeWIGGENSMINICEN 10E
Diamond knifeDiATOMEMX6353
DMP-30SPI companyGS02823Hazardous chemical
DNA transfection reagentThermo Fisher 2696953Lipofectamine 3000 Transfection Kit
Epon 812 SPI companyGS02659Hazardous chemical
EthanolSCR10009218
Fiji image JNational Institutes of Health
Fixative solution 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
FormvarSigma9823
GlycerolSCR10010618
Gold nanoparticlesCorpuscular790120-010
Gradient resinAcetone to resin 3:1, 1:1, 1:3
Hydrofluoric acidSCR10011118
Hydrogen peroxideSCR10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)Easy CLEMv0 Plugin
Imaging chamberThermo Fisher A7816
Large gelatin capsulesElectron Microscopy Sciences70117
Mounting bufferMowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88Sigma9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2OSCR10020318
NaH2PO4 ž2H2OSCR20040718
NMASPI companyGS02828Hazardous chemical
Oligonucleotide primersTakara Biomedical Technology (Beijing)Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.
Oscillating microtomeLeicaVT1000S
Osmium tetroxideSCRL01210302Hazardous chemical
OsO4 solution1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O
ParafilmAmcorPM-996
Paraformaldehyde (PFA)SCR80096618Hazardous chemical
Perfusion buffer4% PFA+0.1 M PB
PioloformSigma63148-65-2Hazardous chemical
Poly-L-lysine Sigma25986-63-0
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) SCR10016818
Scalpel bladesMerckS2771
Scalpel handlesMerckS2896-1EA
StereomicroscopeOLYMPUSMVX10
Transgenic miceThe Jackson LaboratoryVglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g.  
Transmission electron microscope (TEM)FEITECNAL G2
UA solution (2% UA)Aqueous solution
UltramicrotomeLeicaLEICA EM UC6
Uranyl acetate (UA)TED PELLA19481Hazardous chemical

参考文献

  1. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
  2. Kopek, B. G., et al.

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