マウスからの血管壁常在型CD34+ 幹細胞の免疫磁気的単離

要約

この研究は、血管壁に常在するCD34⁺ 幹細胞(CD34⁺ VW-SC)の単離、培養、および機能決定のための安定した効率的な方法を確立しました。このわかりやすく、時間効率の良い分離法は、他の研究者が心血管疾患に関与する潜在的なメカニズムを研究するために利用できます。

要約

常在型CD34⁺ 血管壁常在幹細胞および前駆細胞(VW-SC)は、血管の損傷と修復の調節における重要な役割についてますます認識されています。機能性マウスCD34⁺ VW-SCを安定的かつ効率的に培養する方法を確立することは、さまざまな生理学的および病理学的条件下でこれらの細胞の増殖、遊走、および分化に関与するメカニズムをさらに研究するために不可欠です。記載された方法は、磁気ビーズスクリーニングとフローサイトメトリーを組み合わせて、初代培養常在CD34⁺ VW-SCを精製します。その後、精製された細胞は、免疫蛍光染色とCa²⁺ イメージングによって機能的に同定されます。簡単に説明すると、マウス大動脈および腸間膜動脈の外膜からの血管細胞は、組織ブロックの付着を通じて得られ、続いて細胞数が少なくとも1×10⁷に達するまで継代培養される。続いて、CD34⁺ VW-SCを磁気ビーズソーティングおよびフローサイトメトリーを用いて精製します。CD34⁺ VW-SCの同定には細胞免疫蛍光染色が含まれますが、機能的多能性は、細胞を特定の培地に曝露して配向分化させることによって決定されます。さらに、機能的な内部Ca²⁺ 放出および外部Ca²⁺ エントリーは、ATP、カフェイン、またはタプシガルギン(TG)に曝露されたFura-2/AM負荷細胞において、市販のイメージングワークステーションを使用して評価されます。この方法は、血管壁に常在するCD34⁺ 幹細胞の単離、培養、および同定のための安定した効率的な技術を提供し、VW-SCの調節メカニズムに関する in vitro 研究と標的薬物のスクリーニングの機会を提供します。

概要

血管壁は、血管の発達、恒常性調節、および血管疾患の進行において極めて重要な役割を果たします。近年、多くの研究により、動脈にさまざまな幹細胞系統が存在することが明らかになっています。2004年、Qingbo Xu教授のグループは、成体血管壁の周辺にCD34、Sca-1、c-kit、およびFlk-1¹を発現する血管幹細胞/前駆細胞の存在を初めて報告しました。これらの血管幹細胞は、多方向の分化および増殖能を示します。通常の条件下では、彼らは比較的静止したままです。しかし、特定の因子によって活性化されると、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞に分化することができます。あるいは、パラクリン効果を通じて血管周囲マトリックスと微小血管形成を調節し、損傷した血管の修復またはリモデリングを促進する^{こともできます}2,3,4,5,6。最近、血管壁に常在するCD34⁺幹細胞が、大腿動脈ガイドワイヤー損傷後の内皮細胞の再生に関与することが明らかになった²。したがって、CD34⁺ VW-SCの単離と定量....

プロトコル

この研究は承認され、動物は中国における実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って取り扱われました。この研究は、動物倫理委員会の承認を得て、動物実験の倫理要件を厳格に遵守しました(承認番号:SWMU2020664)。本研究では、体重18〜20 gの男女の8週齢の健康なC57BL / 6マウスを利用しました。動物は、南西医科大学(SWMU)の実験動物センターに収容されました。

1. 大動脈および腸間膜動脈からの外膜の組織ブロック培養

1. 常駐CD34⁺ VW-SCのアイソレーション
   1. 2 匹のマウスに 3% イソフルラン吸入で麻酔をかけます (施設で承認されたプロトコルに従います)。つま先をつまんで十分な麻酔を確認します。マウスを仰臥位に医療用テープで置き、70%エタノール消毒剤をスプレーしてマウスの毛皮を消毒します。滅菌眼科用ハサミと鉗子を使用して胸腔と腹腔を開き、心臓と腸を露出させます。孤立した大動脈と腸間膜動脈を解剖した後、大動脈と腸間膜床をシリコンエラストマーを含み、生理的塩溶液で満たされたペトリ皿に固定します。滅菌されたハサミと鉗子の別のセットを使用して、大動脈と腸間膜動脈の周りの脂肪を迅速に解剖します。
   2. 解剖した組織を、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB溶液を含む6cmのシャーレに移します( 材料の表を参照....

ディスカッション

この研究は、マウスの大動脈および腸間膜動脈から機能的なCD34⁺ VW-SCを取得するための迅速かつ便利な方法を提供します。この方法で得られたCD34⁺ VW-SCは、増殖活性と多方向分化特性を持っています。三リン酸イノシトール1,4,5-三リン酸受容体(IP₃Rs)、リアノジン受容体(RyRs)、および店舗で作動するカルシウムチャネルは、CD34⁺ VW-SCへの^Ca2+の放出と侵入?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023