造血器官からの間質細胞の単離

要約

ここでは、マウスの骨、骨髄、胸腺、およびヒト胸腺組織から間質細胞を単離することを可能にするプロトコルを紹介します。

要約

シングルセルシーケンシングにより、造血器官の間質における不均一な細胞集団のマッピングが可能になりました。これらの方法論は、定常状態でのこれまで未解決の不均一性、および外因性ストレスまたは老化中に誘発される細胞タイプの表現の変化を研究するためのレンズを提供します。ここでは、マウスとヒトの胸腺、およびマウスの骨と骨髄から高品質の間質細胞集団を単離するための段階的なプロトコルを紹介します。これらのプロトコルで単離された細胞は、高品質のシングルセルマルチオミクスデータセットの生成に適しています。ここでは、サンプル消化、造血系数の枯渇、FACS解析/ソーティングの影響、およびこれらの要因がシングルセルシーケンシングとの適合性にどのように影響するかについて説明します。シーケンシング後の解析における解離の成功と非効率性、および下流の間質細胞収量を示すFACSプロファイルの例を用いて、ユーザーにとって認識可能なポインタを提供します。間質細胞の特定の要件を考慮することは、この分野の知識を進歩させる高品質で再現性のある結果を得るために重要です。

概要

健康な成人では、血液細胞のde novo産生は骨髄と胸腺で起こります。これらの部位にある間質細胞は造血の維持に必須であるが、間質^は組織の1,2,3,4の1%未満を構成する。したがって、間質を支える造血の純粋な分離株を得ることは、特に高品質のサンプルを得るために適切な処理を必要とするシングルセルマルチオミクスにとって、大きな課題となります。異なる消化カクテルの成分は、マルチオミクス解析の特定のステップを妨げる可能性があります^5,6。ここで紹介するプロトコルは、骨髄および胸腺組織からの多種多様な間質細胞の単離を詳述しています。

骨髄と胸腺の両方における間質成分の摂動は、血球の発達に深刻な混乱をもたらし、悪性腫瘍を引き起こす可能性があります^7,8,9。間質を支える造血は、細胞傷害性コンディショニングおよび骨髄移植後に損傷を受け、....

プロトコル

ヒト組織を用いたすべての研究は、マサチューセッツ総合病院内部審査委員会(IRB)の承認後に実施されました。すべての動物処置は、マサチューセッツ総合病院の動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って実施されました。本研究では、8-10週齢のC57Bl/6マウス、雄と雌の両方を使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1. マウス胸腺組織の調製

1. 以下のバッファーと溶液を調製します。
   1. ミディアム199(M199)と2%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)( 材料の表を参照)。
   2. マウス解離カクテル:0.5 WU/mL Liberase TMおよび6.3 U/mL DNase I、M199 + 2% FBS中( 材料の表を参照)。
   3. M199 と 2% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA)。
      注:FBSを含む培地は、RNAの品質を向上させるためにBSAに切り替えることができます。
2. マウス胸腺解剖を行う
   1. マウスを_CO2 窒息(施設で承認されたプロトコルに従って)で安楽死させ、背中に置きます。70%エタノールをスプレーして胸の毛皮を濡らし、胸腔....

ディスカッション

造血器官の間質細胞は正常な血液産生に不可欠であり、造血間質の摂動は造血の維持とストレスに対する応答に深刻な障害をもたらす可能性があります^9,23,24。造血間質細胞への洞察は、血液疾患^7,9,10,24を理解し、それらに対?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)	BD Biosciences	559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC	BD Biosciences	643510
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9647
C57Bl/6 mice	Jackson	664	Males or females, 8-12 weeks old
Calcein	Fisher Scientific	65-0853-78
Collagenase IV	Millipore Sigma	C5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm	Fisher Scientific	08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Biolegend	422801
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Dnase I Solution	Thermo Fisher Scientific	90083	2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit	StemCell Technologies	19860
Fetal Bovine Serum	Gibco	A31605-01	Qualified One Shot
Human Fc Block	BD Biosciences	564220
Liberase TM	Millipore Sigma	5401127001	Research Grade
Medium 199	Gibco	12350
Mouse anti-human CD235a-BV77	BD Biosciences	740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594	Biolegend	303130
Mouse anti-human CD45-BV77	Biolegend	304050
Mouse anti-human CD4-BV605	BD Biosciences	562658
Mouse anti-human CD66b-FITC	BD Biosciences	555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7	BD Biosciences	557760
Mouse anti-human EpCam-BV421	Biolegend	324220
Protector RNase Inhibitor	Millipore Sigma	3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594	Biolegend	120424
Rat anti-mouse CD11b-Biotin	Biolegend	101204
Rat anti-mouse CD140a-APC	Fisher Scientific	17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737	BD Biosciences	612802
Rat anti-mouse CD31-BV421	Biolegend	102424
Rat anti-mouse CD3-Biotin	Biolegend	100244
Rat anti-mouse CD45.2-Biotin	Biolegend	109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin	Biolegend	103204
Rat anti-mouse CD51-PE	Biolegend	104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711	BD Biosciences	563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700	Biolegend	108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin	Biolegend	108404
Rat anti-mouse Ter119-Biotin	Biolegend	116204
Rat anti-mouse Ter119-PE	Biolegend	116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7	Biolegend	116222
Stemxyme	Worthington Biochemical	LS004107