ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

要約

このプロトコルはゼブラフィッシュの幼虫の心臓収縮機能を調査し、細胞追跡および相互分析によって心臓力学に洞察を得るのにライトシートイメージ投射を利用する。

要約

ゼブラフィッシュは、その驚くべき心臓再生能力で知られる興味深いモデル生物です。収縮する心臓を in vivo で研究することは、損傷に応答する構造的および機能的変化に関する洞察を得るために不可欠です。しかし、ゼブラフィッシュの心臓の高解像度・高速4次元画像(4D、3D空間+1D時間)画像を取得し、心臓の構造や収縮性を評価することは依然として困難です。これに関連して、社内のライトシート顕微鏡(LSM)とカスタマイズされた計算分析を使用して、これらの技術的制限を克服します。LSMシステムの構築、レトロスペクティブ同期、シングルセルトラッキング、およびユーザー指向の解析を含むこの戦略により、トランスジェニック Tg(myl7:nucGFP) ゼブラフィッシュ幼生の単一細胞分解能で心臓全体の微細構造と収縮機能を調べることができます。さらに、低分子化合物のマイクロインジェクションをさらに取り入れて、正確かつ制御された方法で心臓障害を誘発することができます。全体として、このフレームワークにより、心臓の形態形成と再生中の単一細胞レベルでの生理学的および病態生理学的変化、および局所力学を追跡できます。

概要

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、その光透過性、遺伝的トラクタビリティ、および再生能力により、心臓の発達、生理機能、および修復を研究するために広く使用されているモデル生物です^1,2,3,4。心筋梗塞では、構造的および機能的な変化が心臓駆出と血行動態に影響を与えますが、技術的な制限により、高い時空間分解能で心臓再生中の動的プロセスを調査する能力が引き続き妨げられています。例えば、共焦点顕微鏡などの従来のイメージング法では、複数の心臓周期における動的変化を捉え、心収縮機能を評価するためのイメージング深度、時間分解能、または光毒性の点で限界^{があります5。}

ライトシート顕微鏡は、心臓の心室と心房にレーザーを素早く照射することで、これらの問題にうまく対処し、時空間分解能を高め、光退色や光毒性の影響を無視できる詳細な画像を実現する最先端のイメージング法です6,7,8,9,10,11。^<....

プロトコル

この研究の承認は、テキサス大学ダラス校の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって、プロトコル番号 #20-07 の下で付与されました。本研究では、 Tg(myl7:nucGFP) トランスジェニックゼブラフィッシュ仔魚¹² を使用しました。すべてのデータ取得と画像の後処理は、研究または教育ライセンスを持つオープンソースソフトウェアまたはプラットフォームを使用して実行されました。リソースは、妥当な要求に応じて著者から入手できます。

1. ゼブラフィッシュの育種と胚マイクロインジェクション

タイミング:2日間

1. ゼブラフィッシュの成魚を標準的なケアと繁殖手順で維持・繁殖させる。詳細な方法については、前のレポート¹³を参照してください。
2. 確立されたプロトコル¹⁴ に従ってマイクロインジェクションを実行します。本研究では、マイクロインジェクションを1-2細胞(受精卵)の段階で実施しました。
   注:効果的なマイクロインジェクションのためには、この段階を正確に特定し、発達の一貫性を確保することが重要です。1細胞の段階では、卵黄の上に小さなドームが形成され、この段階は通常約12分間続きま....

ディスカッション

ゼブラフィッシュモデルと工学的手法の統合は、心筋梗塞、不整脈、先天性心疾患のin vivo探索に大きな可能性を秘めています。ゼブラフィッシュの胚や幼生は、その光透過性、再生能力、ヒトとの遺伝的・生理学的類似性を活かして、研究に広く利用されています^1,2,4。優れた時空間分解能、最小限の光損傷、およ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S