無細胞発現系のカプセル化による細菌グルタミン酸受容体チャネルの再構成

要約

このプロトコルは、脂質二重層へのモデル膜タンパク質の合成および取り込みの研究のために、巨大単層小胞(GUV)内に無細胞発現(CFE)システムをカプセル化するために使用される逆エマルジョン法を説明しています。

要約

無細胞発現(CFE)システムは、合成生物学における強力なツールであり、合成細胞におけるバイオセンシングやエネルギー再生などの細胞機能のバイオミミクリーを可能にします。しかし、広範囲の細胞プロセスを再構築するには、膜タンパク質を合成細胞の膜にうまく再構成する必要があります。可溶性タンパク質の発現は通常、一般的なCFEシステムで成功しますが、合成細胞の脂質二重層における膜タンパク質の再構成は困難であることが証明されています。本研究では、モデル膜タンパク質である細菌のグルタミン酸受容体(GluR0)を巨大単層小胞(GUV)に再構成する方法を、合成細胞内でCFE反応をカプセル化し、インキュベーションすることに基づいて、モデル合成細胞として紹介します。このプラットフォームを利用して、GluR0のN末端シグナルペプチドをプロテオロドプシンシグナルペプチドに置き換えることで、GluR0のハイブリッドGUVの膜への共翻訳転座の成功に対する効果が実証されます。この方法は、合成細胞中のさまざまな膜タンパク質を無細胞で再構成することを可能にする堅牢な手順を提供します。

概要

ボトムアップ合成生物学は、バイオエンジニアリング、ドラッグデリバリー、再生医療など、数多くの応用が期待できる新興分野として、過去10年間で関心が高まっています^1,2。特に、ボトムアップ合成生物学の礎石としての合成細胞の開発は、合成細胞の有望な応用と、in vitro生物物理学的研究を容易にするその細胞様の物理的および生化学的特性により、幅広い科学コミュニティを引き付けています3,4,5,6 .合成細胞は、多くの場合、細胞サイズの巨大単層小胞(GUV)で操作され、そこでさまざまな生物学的プロセスが再現されます。細胞細胞骨格^{の再構成7,8}、光依存性エネルギー再生⁹、細胞コミュニケーション^10,11、およびバイオセンシング¹²

プロトコル

この研究に使用した試薬と機器は、 資料表に記載されています。

1. 小さな単層小胞(SUV)の存在下でのバルクCFE反応

1. SUVの準備
   注:この手順は、クロロホルムの使用に関する安全指示に従って、ドラフト内で実行する必要があります。
   1. ガラスバイアルに5 mM 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)SUVを調製するには、クロロホルムに溶解した25 mg/mL POPCストック溶液76 μLを移します。
   2. ガラスバイアルを静かに回転させながら、アルゴンをバイアルに穏やかに吹き込み、底に乾燥脂質の膜を形成します。次に、ガラスバイアルをデシケーターに移し、キャップを緩くねじ込んで余分なクロロホルムを蒸発させます。
   3. ガラスバイアルをデシケーターに1時間保管します。その後、0.5mLの超純脱イオン水を加えて脂質膜を溶解し、約2分間ボルテックスします。
   4. 2つのフィルターサポートを脱イオン水に浸し、それらを各内膜サポートに配置することにより、ミニ押出装置をセットアップします。次に、100 nmのポリカーボネートフィルターを浸し、エクストルーダーのアウターケーシングとリテーナーナットで一緒に保持されている2つの内部メンブレンサポートの間に置きます。このセットアップをエクストルーダースタンドに....

ディスカッション

細胞シグナル伝達や細胞の興奮など、細胞膜を介した分子や情報の伝達に依存するほぼすべての細胞プロセスには、膜タンパク質が必要です。このように、膜タンパク質の再構成は、さまざまなアプリケーション向けのさまざまな合成細胞設計を実現する際の主要なボトルネックとなっています。従来の界面活性剤による生体膜中の膜タンパク質の再構成には、緩やかな膨潤や電気形成など?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm polycarbonate filter	STERLITECH	1270193
96 Well Clear Bottom Plate	ThermoFisher Scientific	165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader	Agilent	11-120-533
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Millipore Sigma	D1556	Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports	Avanti	610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Folinic acid calcium salt hydrate	Millipore Sigma	F7878
Glucose	Millipore Sigma	158968
HEPES	Millipore Sigma	H3375
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1501
Light mineral oil	Millipore Sigma	M5904
Magnesium acetate tetrahydrate	Millipore Sigma	M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)	Avanti	610020
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olympus	1-U2B933
PEO-b-PBD	Polymer Source	P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
POPC lipid in chloroform	Avanti	850457C
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
PUREfrex 2.0	Cosmo Bio USA	GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set	New England BioLabs	N0450
RNase Inhibitor, Murine	New England BioLabs	M0314S
RTS Amino Acid Sampler	Biotechrabbit	BR1401801
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888
Spermidine	Millipore Sigma	S2626
Sucrose	Millipore Sigma	S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600	ELITechGroup	VAPRO 5600