間質流を有する浸潤性神経膠腫微小環境の光重合性ヒアルロン酸コラーゲンモデル

要約

私たちは、間質液の流れを組み込んだ浸潤前部の神経膠腫腫瘍微小環境を再現する方法を提示します。このモデルは、ヒアルロン酸-コラーゲンI型ハイドロゲルを組織培養インサートに含ませたもので、液圧ヘッドを適用することができる。浸潤を定量化し、細胞を単離または溶解することができます。

要約

膠芽腫の再発は、治療の成功に対する主要な障害であり、外科的切除にアクセスできない健康な組織への神経膠腫幹細胞(GSC)の浸潤によって引き起こされます。組織レベルの体液移動、または間質性流体の流れ(IFF)は、腫瘍微小環境(TME)に依存する方法でGSCの浸潤を調節し、IFFとTMEの両方を組み込んだモデルシステムの必要性を強調しています。我々は、神経膠芽腫における浸潤性TMEを再現するためのアクセス可能な方法、すなわちヒトGSC、アストロサイト、および組織培養インサートに播種されたミクログリアからなるヒアルロン酸-コラーゲンIハイドロゲルを提示する。上昇したIFFは、ハイドロゲルに流体圧力ヘッドを適用することで表すことができます。さらに、このモデルは、細胞比、流量、またはマトリックスの剛性における患者間または患者内の違いを再現するように調整できます。浸潤は定量化でき、ゲルはGSC浸潤、フローサイトメトリー、タンパク質またはRNA抽出、イメージングなど、さまざまな結果を得ることができます。

概要

膠芽腫は、臨床的に利用可能な治療法^2,3によって中等度にしか延長されない短い生存期間¹を特徴とする壊滅的な疾患です。効果的な治療に対するこの障害は、主に、切除や再発腫瘍の播種にアクセスできない化学療法抵抗性神経膠腫幹細胞(GSC)の高浸潤性の性質によって引き起こされています⁴。同時に、GSCは高度に可塑性であり、腫瘍微小環境(TME)の多様な刺激に応答して生存し、侵入します^5,6。具体的には、人口密度の高い腫瘍と漏出性血管系は、腫瘍の境界で急激な圧力差を生み出し、GSC浸潤と相関する異なる領域で間質液の流れ(IFF)を増加させます⁷。この増加したIFFは^8,9,10に影響を及ぼし、薬理学的阻害に適した分子経路を介して^8,9GSCの浸潤をし....

プロトコル

このプロトコルは、Virginia Tech Institutional Biosafety Committeeによって定められたガイドラインに準拠して開発されました。

注:特に指定がない限り、すべての手順はBSL-2細胞培養キャビネットで行ってください。ヒト細胞の使用に関するガイダンスについては、機関のバイオセーフティ委員会にご相談ください。

1. ゲル調製の計算

1. 実験に必要な条件の数を計算します。
   注:「条件」は、溶液の含有量(細胞濃度、コラーゲン濃度など)によって定義され、この例で使用されている流体圧力ヘッドのような外部から適用される変数ではありません。
2. 各条件溶液に必要なゲルの総量を計算します。
   注:直径12 mmの組織培養インサートを使用する12ウェルゲルに必要な容量は、インサートあたり100〜150 μLです。侵入を定量化する際には、少なくとも 3 回の技術的な反復が推奨されます。さらに、ピペッティングエラーによる容量損失を考慮するために、各条件溶液に追加の複製のボリュームを追加します。
3. ステップ1.2から実験に必要なゲル溶液の総量を計算します。
4. 実験に必要な3 mg/mLコラーゲン溶液の総量を計算します。ピペッティン....

ディスカッション

TMEモデルの組み立てには、1)細胞を継代し、同様の条件間で細胞を分離する、2)すべての条件に対して濃縮コラーゲン溶液を組み立てる、3)各条件にゲル成分(細胞、コラーゲン、メタクリル化ヒアルロン酸、光開始剤)を組み合わせる、4)ゲルをめっきする、5)UV曝露と熱による架橋、6)流体圧力ヘッドを追加する、の6つの基本的なステップが含まれます。18時間以上経?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Well Tissue Culture Plate, Sterile	Celltreat Scientific Products	229112
250 mL Filter  System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, Sterile	DOT Scientific	667706
385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA	Thorlabs	M385LP1-C1
75cm2 Tissue Culture Flask - Vent Cap, Sterile	Celltreat Scientific Products	229341
8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm Diameter	Millicell	PI8P01250
Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology Grade	Thermo Fisher Scientific	T038181000CS	Ethanol for flow cytometry dead cell control.
Astrocyte Medium (Astrofull)	ScienCell Research Laboratories	1801	Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin.
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12587010
BSA (MACS)	Miltenyi Biotec	130-091-376
CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen)	Fisher Scientific	25-0719-41
Cell Counting Chambered Slides	Nexcelom Bioscience	CHT4-PD100-002
Cell Scrapers	Biologix USA	70-1250
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience)	VWR	NEXCCMK2-SK150-FCS
Centrifuge - Low-Speed	Eppendorf	5702 R	Centrifuge for cell culture.
Clear Polystyrene 96-Well Microplates, Corning	Fisher Scientific	07-200-108	V-bottom plates for flow cytometry staining.
CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)	Thermo Fisher Scientific	50116047
Collagen I, High Concentration, Rat Tail	Corning	354249
Collagen I, Rat Tail	Corning	354236	"Low" concentration for coating adherent flasks.
Collagenase (CAS# 9001-12-1)	United States Biological	C7511-30
Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 - 700 nm	Thorlabs	COP1-A
Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips	Amazon	B01KCJB3R2
Dispase (CAS# 9001-92-7)	United States Biological	D3760
DMEM, high glucose (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11330032
EVOS FL	Invitrogen	AMF4300
Fetal Bovine Serum (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	26140079	For microglia culture.
Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich)	Millipore Sigma	HT501128
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	00-5523-00
Glioma stem cells	n/a	n/a	Can be patient derived or commercial glioma stem cell lines.
Guava easyCyte HT System	Millipore Sigma	0500-4008	Flow cytometer.
HBSS (Sigma-Aldrich)	Millipore Sigma	H6648
HEPES (1 M) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	15630080
High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max	Thorlabs	DC2200	Interface for UV Lamp.
Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific)	Thermo Fisher Scientific	62249
Human Astrocytes	ScienCell Research Laboratories	1800	Primary astrocytes derived from the cerebral cortex.
Human EGF Recombinant Protein (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	PHG0021
Immortalized Human Microglia - hTERT	Applied Biological Materials	T0251
Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 position	Benchmark Scientific	H6002
Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibody	Miltenyi Biotec	130-120-420
LED UV Curing Meter	Gigahertz-Optik	X1-RCH-116	Optometer to measure UV light intensity.
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Advanced Biomatrix	5269-100MG	Photoinitiator.
LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	L24975
Methacrylated hyaluronic acid (photoHA)	Advanced Biomatrix	5212-100MG
Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)	Fisher Scientific	75-997-203	Centrifuge for flow cytometry staining.
N-2 Supplement (100X) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	17502048
Neurobasal-A Medium (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	10888022
PBS (10X), pH 7.4 without Ca & Mg	Quality Biological	119-069-101
Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2)	VWR	97064-476
Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma)	Fisher Scientific	SYNS0HFUS
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	25200056
ViaStain AOPI Staining Solution	Nexcelom Bioscience	CS2-0106