低酸素感受性キメラ抗原受容体T細胞の作製と機能検証

要約

ここでは、低酸素感受性キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の作製と機能検証のためのプロトコールを紹介します。このプロトコルは、レンチウイルスベースの低酸素感受性CAR-T細胞の作製と、低酸素依存性CAR発現および選択的細胞毒性の検証を含むそれらの特性評価を示しています。

要約

広範な研究により、血液悪性腫瘍の治療におけるキメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法の有望性が証明されています。しかし、固形腫瘍の治療は依然として困難であり、CAR-T細胞が標的抗原を発現する正常細胞を攻撃する際に生じる安全性の懸念に代表されるようになっています。研究者らは、CAR-T細胞療法の腫瘍選択性を高めるためのさまざまなアプローチを模索してきました。この方針に沿った代表的な戦略の1つは、酸素依存性分解ドメインをCAR部分に融合させることによって設計され、低酸素環境、つまり腫瘍微小環境(TME)でのみ高いCAR発現を達成するように戦略化された低酸素感受性CAR-T細胞の構築です。この論文では、このようなCAR-T細胞の作製とその機能特性評価のためのプロトコルを提示し、移動型インキュベーターチャンバーによって確立されたさまざまな酸素レベルに応じたCAR発現と殺傷能力の変化を分析する方法を含めます。構築されたCAR-T細胞は、酸素感受性でCAR発現と細胞毒性を示すことが期待されており、したがって、低酸素TMEと正常酸素正常組織を区別して選択的活性化を行う能力をサポートします。

概要

キメラ抗原受容体T細胞(CAR-T)療法は、がん治療における大きなブレークスルーを表しています。2017年に米国食品医薬品局(FDA)が進行性/抵抗性リンパ腫および急性リンパ性白血病の治療薬として初めてCAR-T療法を承認して以来、CD19またはB細胞成熟抗原(BCMA)を標的とするCAR-T療法は、^{全世界で1、2、3}、10が承認を受けています4。しかし、広範な研究にもかかわらず、血液悪性腫瘍の治療におけるCAR-T療法の顕著な有効性を再現することは、固形腫瘍5,6,7,8への適用にとって依然として困難です。

免疫抑制性腫瘍微小環境(TME)は、固形腫瘍環境におけるCAR-Tの有効性が低い主な原因です。TMEは、不十分な栄養素、低酸素症、酸性pH、および代謝老廃物の蓄積により、CA....

プロトコル

本研究では、HER2(Gene ID:2064)を標的とする低酸素感受性CARであるHER2-BBz-ODDと、通常のHER2-BBzと比較しました。2つのCARの概略図を 図1Aに示し、HER2-BBz-ODDは、CD3ξのC末端にODD配列を追加することでHER2-BBzから得られることを示しています。2つのCARを発現するレンチウイルスベクターの構築と、293T細胞トランスフェクションによる対応するレンチウイルスの生成は、以前に説明されている³¹。

1. レンチウイルス感染による低酸素感受性CAR-T細胞の作製

1. 凍結保存されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)を37°Cで水浴中で急速に解凍します。解凍したPBMCを、400 IUのIL-2、5 ng/mL IL-7、および10 ng/mL IL-15を添加した9 mLの無血清リンパ球培養培地(ヒトT細胞増殖培地、 以下 TGM と呼ぶ)を含む15 mLチューブに移します。
2. 細胞計数用の分注を取った後、チューブを300 × g で5分間遠心分離します。ペレット化したPBMCをTGMで4×10

ディスカッション

安全性に関する懸念は、CAR-T細胞療法が臨床使用に進むために対処しなければならない重要な問題です。腫瘍細胞またはTMEのユニークな特性を利用することは、腫瘍組織を選択的に標的とするCAR-T細胞の開発に焦点を当てた主要な研究の方向性となっています。低酸素感受性CAR-Tの設計は、この方向での魅力的な戦略であり、この研究で提示されたアプローチ、つまり.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge tube	QSP	509-GRD-Q	Supernatants and cells cellection Protocol Step 2,3,4
10% ExpressCast PAGE	NCM biotech	P2012	Immunoblotting Protocol Step 3
10x PBS	NCM biotech	20220812	Cell culture Protocol Step 4
10 mL pipette	Yueyibio	YB-25H	Pipetting Protocol Step 1
10xTRIS-Glycine-SDS electrophoresis buffer	Epizyme	3673020	Immunoblotting Protocol Step 3
15 mL Centrifuge tube	Thermo Scientific	339650	Supernatants and cells cellection Protocol Step 1
25 cm2 EasYFlask	Thermo Scientific	156367	Cell culture Protocol Step 3,4
4x Protein SDS PAGE Loading Buffer	Takara	9173	Immunoblotting Protocol Step 3
6-well flat-bottom tissue culture plates	Thermo Scientific	140675	T Cells culture Protocol Step 1
96-well black flat-bottom tissue culture plates	Greiner	655090	Cytotoxicity assay Protocol Step 4
96-well ELISA plates	Corning	3590	ELISA Protocol Step 5
96-well plate shaker	QILINBEIER	MH-2	Shake Protocol Step 4
96-well U-bottom tissue culture plates	Thermo Scientific	268200	Supernatants cellection Protocol Step 4,5
anti-FLAG antibody	Sigma	F1804-50UG	Immunoblotting Protocol Step 3
Carbinol	Sinopharm	10010061	Immunoblotting Protocol Step 3
Carbon dioxide incubator	Thermo Scientific	360	Cell culture Protocol Step 1,2,3,4
Cell counting plate	Hausser scientific	1492	Cell counting Protocol Step 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG Kit	Thermo Scientific	11531D	Mouse IgG magnetic beads Protocol Step 1
Centrifuge	Thermo Scientific	75002432	Cell culture Protocol Step 1,3,4
Chemiluminescence gel imaging system	BIO-RAD	12003154	Immunoblotting Protocol Step 3
Cobalt chloride solution (0.5 M)	bioleaper	BR4000203	Hypoxic condition Protocol Step 2,3,4
DMEM	Corning	10-103-CV	Cell culture Protocol Step 4
Electronic balance	Sartorius	PRACTUM612-1CN	weigh Protocol Step 5
FBS	BI	04-001-1ACS	Cell culture Protocol Step 3,4
GAPDH Mouse mAb	ABclonal	AC002	Immunoblotting Protocol Step 3
Gel electrophoresis apparatus	BIO-RAD	1645070	Immunoblotting Protocol Step 3
GloMax Microplate Readers	Promega	GM3000	luciferase activity measurement Protocol Step 4
Goat anti-Mouse IgG (H+L)	Yeasen	P1126151	Immunoblotting Protocol Step 3
High speed microfreezing centrifuge	eppendorf	5810 R	Cell culture Protocol Step 1
Human IFN-γ ELISA Set	BD	555142	ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IFN-γ Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IFN-γ , Capture Antibody Purified Anti-Human IFN-γ, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
Human IL-2 ELISA Set	BD	555190	ELISA Protocol Step 5 Items: Recombinant Human IL-2 Lyophilized Standard, Detection Antibody Biotin Anti-Human IL-2 , Capture Antibody Purified Anti-Human IL-2, Enzyme Reagent Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
IL-15	R&D systems	P40933	T Cells culture Protocol Step 1
IL-21	Novoprotein	GMP-CC45	T Cells culture Protocol Step 1
IL-7	R&D systems	P13232	T Cells culture Protocol Step 1
Inverted microscope	Olympus	CKX41	Cell culture Protocol Step 1,3,4
Jurkat	ATCC	TIB-152	CAR-Jurkat construction Protocol Step 3
LSRFortessa	BD	LSRFortessa	Flow cytometry Protocol Step 2
Luciferase Assay System	Promega	E1501	luciferase reporter assay Protocol Step 4 Items: Passive lysis buffer, firefly luciferase substrate
Microplate reader	BioTek	HTX	ELISA Protocol Step 5
mobile CO2/O2/N2 Incubator Chamber	China Innovation Instrument Co., Ltd.	Smartor118	Hypoxic condition Protocol Step 2, 3, 4
Mouse Anti-Hexa Histidine tag	Sigma	SAB2702218	Immunoblotting Protocol Step 3
NcmBlot Rapid Transfer Buffer	NCM biotech	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM biotech	P10300	Immunoblotting Protocol Step 3 Items: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A) ,NcmECL Ultra Stabilized Peroxide Reagent (B)
NovoNectin -coated 48-well flat plates	Novoprotein	GMP-CH38	CAR-T cells construction Protocol Step 1
OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) tablet set	Sigma	P9187	Substrate Reagent Protocol Step 5 Items: OPD tablet (silver foil),urea hydrogen peroxide tablet (gold foil)
PE-conjugated anti-DYKDDDDK	Biolegend	637310	Flow cytometry Protocol Step 2
Protamine sulfate	Sigma	P3369-1OG	Lentivirus infection Protocol Step 1
Protein Marker 10 Kda-250 KDa	Epizyme	WJ102	Immunoblotting Protocol Step 3
Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	566685	T Cells culture Protocol Step 1
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725	T Cells culture Protocol Step 1
PVDF membrane	Millipore	168627	Immunoblotting Protocol Step 3
RPMI 1640	Corning	10-040-CVRC	Cell culture Protocol Step 3
Skim milk powder	Yeasen	S9129060	Immunoblotting Protocol Step 3
SKOV3-Luc	ATCC	HTB-77	Cytotoxicity assay Protocol Step 4
Trypsin-EDTA	NCM biotech	C125C1	Cell culture Protocol Step 4
Tween 20	Sinopharm	30189328	Immunoblotting Protocol Step 3
Water bath	keelrein	NB014467	Heating Protocol Step 1
X-VIVO 15	LONZA	04-418Q	Serum-free lymphocyte culture medium Protocol Step 1