げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング

要約

このプロトコルは、高度なライトシート顕微鏡法と適応した組織透明化法を利用して、げっ歯類の心臓の複雑な心臓構造を調査し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。

要約

ライトシート顕微鏡(LSM)は、心臓の複雑な3次元(3D)構造を理解する上で極めて重要な役割を果たし、基本的な心臓生理学と病理学的反応に関する重要な洞察を提供します。ここでは、マウスモデルにおける心臓のマイクロアーキテクチャを解明するためのLSM技術の開発と実装を掘り下げます。この手法は、カスタマイズされたLSMシステムと組織透明化技術を統合し、体積イメージングのための心臓組織内の光散乱を軽減します。従来のLSMと画像スティッチングおよびマルチビューデコンボリューションアプローチを組み合わせることで、心臓全体をキャプチャできます。軸方向の分解能と視野(FOV)の間の固有のトレードオフに対処するために、焦点の合っていない光を最小限に抑え、伝搬方向全体で心臓を均一に照らす軸方向に掃引ライトシート顕微鏡(ASLM)法をさらに導入します。一方、iDISCOなどの組織透明化法は、光の透過性を高め、深部構造の可視化を容易にし、心臓全体の心筋を包括的に検査することができます。提案されたLSMと組織透明化法の組み合わせは、げっ歯類の心臓の心臓構造を解明する上で研究者にとって有望なプラットフォームを提供し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。

概要

心不全は、主に成熟した心筋細胞の再生能力の欠如により、世界中で依然として主要な死亡原因となっています¹。心臓の複雑な構造は、その機能において重要な役割を果たし、発達過程への洞察を提供します。心筋梗塞に対する心臓の形態形成やリモデリングの根本的な過程を解明するためには、心臓の構造を深く理解することが不可欠です。近年の進歩により、新生児マウスは損傷後に心機能を回復できるが、成体マウスにはそのような再生能力がないことが示されている²。これにより、マウスモデルの構造的および機能的異常に関連する手がかりを調査するための基盤が確立されます。共焦点顕微鏡などの従来のイメージング方法には、透過深度の制限、低速な点走査方式、レーザー光への長時間の曝露による光損傷などの技術的な制限があります。これらは、無傷の心臓の包括的な3次元(3D)イメージングを妨げます。これに関連して、ライトシート顕微鏡(LSM)は強力なソリューションとして浮上し、高速イメージング、写真による損傷の低減、および卓越した光学セクショニング機能の利点を提供します^3,4,5。LSMのユニークな特徴は、従来の技術の限界を克服するための有望な方法として位置付けられ、心臓の発生とリモデリングプロセスに関する前例....

プロトコル

動物実験は、テキサス大学ダラス校の動物管理・使用委員会(IACUC #21-03)の監督下で承認され、実施されています。この研究では、出生後1日目(P1)の新生児と8週齢の成人を含むC57BL6マウスを使用しました。雄と雌の間に差は観察されませんでした。すべてのデータ取得と画像後処理は、研究または教育ライセンスを取得したオープンソースソフトウェアまたはプラットフォームを使用して実行されました。リソースは、合理的な要求に応じて著者から入手できます。

1.サンプル調製と組織透明化(6〜10日)

1. 組織透明化手順を開始する前に、組織透明化方法に必要なすべての化学溶液を材料 表 で調製してください。
   注意: 特に有毒化学物質を取り扱う場合は、適切な個人用保護具を着用しながら、ドラフトですべての手順を実行してください。
2. 動物を_CO2 で安楽死させるには、P1や8週間などの所望の時点で_CO2 チャンバーに入れて心臓全体を採取し、新たに分離した心臓を室温(RT)で0.2M KClに浸して拡張期¹⁶で停止します。
3. 心臓の解剖学的構造を4°Cで保存するために、ロッカーで一晩穏やかに攪拌しながら、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を浸して心....

ディスカッション

イメージング、計算、および組織透明化方法の進歩は、心臓の構造と機能を広範囲に調査する比類のない機会を提供しました。これは、無傷のげっ歯類の心臓モデルを使用して、心臓の形態形成と病因の理解を深める大きな可能性を秘めています。同様のアプローチを用いたゼブラフィッシュの心臓のin vivo研究40,41,42,43とは対照的に、高度なLSM技術と組織透明化法の統合によ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Agarose
Low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
Chemicals for tissue clearing
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans	Sigma-Aldrich	118184
D.E.R.™ 332	Sigma-Aldrich	31185
D.E.R.™ 736	Sigma-Aldrich	31191
Dibenzyl ether (DBE)	Sigma-Aldrich	33630
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2)	Sigma-Aldrich	216736
Methanol	Sigma-Aldrich	439193
Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Fisher	47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	79383
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Software and algorithms
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
BigStitcher	Hörl et al.22
Fiji-ImageJ	Schindelin et al.20	1.54f
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom body	Olympus	MVX-ZB10
10X Illumination objective	Nikon	MRH00105
1X detection objective	Olympus	MV PLAPO 1X/0.25
473nm DPSS Laser	Laserglow Technologies	LRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laser	Laserglow Technologies	LRS-0589-GFF-00100-05
BNC connector	National Instrument	BNC-2110
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axes	Physik Instrumente	C-884.4DC
ETL	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL Cable	Optotune	CAB-6-300
ETL Lens Driver	Optotune	EL-E-4i
Filter	Chroma	ET525/30
Filter	Chroma	ET585-40
Filter	Chroma	ET645-75
Filter wheel	Shutter Instrument	LAMBDA 10-B
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.20DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	L-406.40DG10
Motorized translation stage	Physik Instrumente	M-403.4PD
NI multifunction I/O	National Instrument	PCIe-6363
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Stepper motor	Pololu	1474
Tube lens	Olympus	MVX-TLU