マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

要約

このプロトコルは、マウスの心臓の発達における心臓細胞のエレクトロポレーションベースのトランスジェネシスのための詳細な方法論的フレームワークを示しています。ここで提供されるビデオアセットは、この汎用性の高い手法の学習を容易にします。

要約

哺乳類の心臓は、非常に多様な前駆細胞集団 を介して 発生中に形成される複雑な器官です。これらの先駆者の起源、加入のタイミング、および運命は、この器官の適切な発達にとって重要です。心臓の形態形成を支配する分子機構は、先天性心疾患の病因や胚性心臓再生の理解に不可欠です。これらのメカニズムを調査するための古典的なアプローチでは、トランスジェニックマウスの作製を使用して、心臓発生中の特定の遺伝子の機能を評価しました。しかし、マウスのトランスジェネシスは複雑で時間のかかるプロセスであり、心臓の発達における特定の遺伝子の役割を評価するために実行できないことがよくあります。これに対処するために、マウス胚の心臓の効率的なエレクトロポレーションと培養のためのプロトコルを開発し、一過性トランスジェネシスが心臓の発生に関与する遺伝子の機能獲得または機能喪失の影響を迅速に評価できるようにしました。この方法論を用いて、心外膜細胞トランスフェクションを好む胚性心臓におけるMeis1の過剰発現に成功し、この技術の能力を実証しました。

概要

心臓は、胚発生中に形成される最初の器官です。このプロセスには、胚の異なる領域から得られる前駆細胞のさまざまな集団の時空間的な調整が含まれます。これらはすべて、発達中の心臓が鼓動し、機能し続ける間に起こり、その形成に必要な顕著な協調性が強調されています^1,2,3。心臓の重要な役割を考えると、細胞レベルおよび分子レベルでの厳密な制御は、その適切な形成に不可欠です^4,5。心臓の発達を制御するメカニズムを特定することは、世界中のかなりの数の患者に影響を与える先天性心疾患の解明に不可欠であるため、非常に興味深いものでした⁶。さらに、出生後の哺乳類の心臓は、成人期に失われたり妨げられたりする再生能力を保持しているため、心臓の発達を理解することは心臓の再生を解読する上で極めて重要です^7,8。したがって、先天性心疾患と心臓再生に関する研究を進めるためには、心臓発生の分子調節因子を解剖することが不可欠です。

この目的を追求するため....

プロトコル

すべての動物実験は、CNIC動物実験倫理委員会によって承認され、EU指令2010/63EUおよび勧告2007/526/ECを含む現行の法律に準拠しており、Real Decreto 53/2013に基づくスペインの法律によって施行されています。このプロトコルのために、15〜21週齢の雌の野生型CD-1マウスを用いた。使用した動物、試薬、機器の詳細については、 資料表に記載しています。

1. プラスミドとツールの準備

1. まず、目的のプラスミドDNAを最終濃度1 μg/μLの氷に添加して、エレクトロポレーションミックスを調製します。次に、スクロースを最終濃度6%(PBSに溶解)、生体適合性色素を0.01%で添加して混合物を完成させ、最終容量が30 μLになるまでPBSで完成させます。
   注:サンプルあたり約1〜2μLのエレクトロポレーションミックスが使用されます。エレクトロポレーションミックスの比率を、実験のサンプル数に応じてスケールします。エレクトロポレーション用のDNAは、最適な安定性と最小限の汚染物質を確保するために、細菌培養物から精製する必要があることを忘れないでください。本試験で使用したプラスミドの詳細については、代表的な結果のセクションをご覧ください。
2. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)、2....

ディスカッション

全体として、ここで説明する方法論は、Meis1の過剰発現(図4C)で示されているように、発生中の心外膜(図4B)でトランスジェニックコンストラクトを発現するための堅牢なフレームワークを提供します。適切なコンストラクトを使用すると、このプロトコルを使用して、特定の遺伝子の機能獲得(GOF)または機能喪失(LOF)の影響を一過性に評価できます?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Forceps	Dumont	11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate	BD Falcon	353043
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
40 µm Cell Strainer	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL tubes	BD Falcon	352070
70 µm Cell Strainer	Corning	CLS431751
Anti-GFP Policlonal Antibody	Invitrogen	A10262	1:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody	Invitrogen	14-6503-82	1:500 dilution used
CD1 Wild Type mice			Provided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signalling Technologies	9661	1:400 dilution used
DAPI	Cell Signalling Technologies	4083	1:1000 dilution used
Dispase/collagenase	Roche	10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10313021
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0	Leica	11524102
Liberase	Roche	5401119001
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG expression plasmid	Addgene	#89689
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri dishes 35 × 10 mm	BD Falcon	351008
Petri dishes 60 × 15 mm	BD Falcon	353002
Phenol Red	Merck	P3532
Pipette tips			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody	Abcam	ab89901	1:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SC	Nepa Gene	CUY664-10X15
Sterile PBS			Provided and autoclaved by technical unit
Sucrose	Millipore	84100
Tweezer electrodes with variable gap	Nepa Gene	CUY650P5