シングルセルRNAシーケンシングのためのヒトおよびマウス腫瘍組織サンプルの解離

要約

このプロトコルは、シングルセルRNAシーケンシングのためにヒトとマウスの腫瘍サンプルを迅速に解離する手順を概説しています。

要約

ヒト腫瘍サンプルは、その微小環境と免疫レパートリーに関する大量の情報を保持しています。ヒト組織サンプルを生存細胞懸濁液に効果的に解離させることは、シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)パイプラインに必要なインプットです。バルクRNAシーケンシングアプローチとは異なり、scRNAseqは、腫瘍標本の転写不均一性をシングルセルレベルで推測することができます。近年、このアプローチを取り入れることで、免疫細胞や腫瘍細胞の状態、免疫療法などの治療に対する臨床反応に関連するプログラムの同定など、多くの発見が生まれています。さらに、解離組織に適用されたシングルセル技術を使用して、DNAバーコード抗体(CITEseq)を使用して、アクセス可能なクロマチン領域T細胞およびB細胞受容体レパートリー、およびタンパク質の発現を同定できます。

これらの技術を使用する際には、解離したサンプルの生存率と品質が重要な変数であり、これらは単一細胞と周囲のRNAとの交差汚染、データの品質、および解釈に劇的な影響を与える可能性があります。さらに、長時間の解離プロトコルは、敏感な細胞集団の排除とストレス応答遺伝子シグネチャのアップレギュレーションにつながる可能性があります。これらの制限を克服するために、私たちは迅速な普遍的な解離プロトコルを考案し、これは複数のタイプのヒトおよびマウス腫瘍で検証されています。このプロセスは、機械的および酵素的解離から始まり、ろ過、赤血球溶解、および細胞のインプットが少ないサンプル(針コア生検など)に適した生死濃縮が続きます。このプロトコールは、ゲルビーズインエマルジョン(GEM)の正常な生成、バーコード化、およびシーケンシングにとって最も重要な、クリーンで生存可能なシングルセル懸濁液を保証します。

概要

がん研究の多くの進歩により、免疫細胞や腫瘍細胞に発現する阻害性受容体を標的とする薬剤(チェックポイント阻害薬として知られる)の開発とFDAの承認につながったが、治療抵抗性や患者の反応を促進するメカニズムの特定は依然として課題となっている¹。腫瘍の不均一性をその分子多様性と腫瘍細胞と免疫微小環境との間の複雑な相互作用で特徴付けるという複雑な課題は、この複雑な生態系を単一細胞の分解能で解剖するための新しいアプローチを必要としています。腫瘍とその微小環境内の分子の複雑さを理解することは、治療戦略を進歩させ、がんの進行の根底にある複雑な生物学を解読するために極めて重要です²。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、複雑な腫瘍サンプル内の個々の細胞を高分解能で解析できるため、ますます人気が高まっています^3,4。

遺伝的、エピジェネティック、表現型の多様性を包含する腫瘍の不均一性は、がん生物学の複雑さを明らかにする上で課題を提起しています⁵。従来のバルクRNAシーケンシングの方法では、腫瘍内に存在する不均一な細胞集団のユニークな発現プロファイルと表現型が不明瞭になる傾向があります。これらの方法は、細胞集団全体のシグナルを平均化するためです⁴。対照的に、scRNA-seqは個々の細胞タイプの解剖を可能にし、多様な遺伝子発現、抑制パターン、および他の方法では見落とされていた細胞状態を明らかにする^4,6。scRNA-seqの前提は、個々の細胞の遺伝的および分子的特徴を解読する能力にあり、新しいがん治療薬の発見に大きな期待が寄せられています⁷。

腫瘍細胞とその周辺間質細胞および免疫細胞の遺伝子発現プロファイルを解読することにより、研究者は新しい治療標的を特定し、個々の患者に合わせた精密な遺伝子医療戦略を開発することができます⁶。さらに、腫瘍微小環境内の免疫レパトアを解剖することで、腫瘍細胞と免疫エフェクターの相互作用に関する重要な洞察が得られ、免疫療法的介入への道が開かれます³。臨床サンプルでのscRNAseqの使用が進歩しているにもかかわらず、処理ステップ中のいくつかの課題は、細胞のRNAの完全性、生存率、および生成されたデータの品質を損なう可能性があります。さらに、細胞生存率の低い組織をプロセッシングすると、個々の細胞のカプセル化中に生成される液滴中の周囲RNAレベルが上昇し、細胞タイプのクロスコンタミネーションや誤ったアノテーションが生じる可能性があります。一方、37°Cで長時間の解離プロトコルを実行すると、複数の細胞タイプでストレス応答遺伝子シグネチャーがアップレギュレーションされる可能性があります^8,9。10.

このプロトコルで概説されている段階的な手順(図1A)は、腫瘍の迅速な機械的および酵素的解離から始まり、続いて、各腫瘍サンプルの生存率に応じて、死んだ細胞のろ過と除去が行われます。現在、この手順は、黒色腫¹¹、結腸直腸¹²、頭頸部扁平上皮癌¹³、膵臓および肺 (未発表データ) 腫瘍サンプルで確認されています。これらの技術により、下流の分析に不可欠な高品質の生細胞懸濁液の生成が保証されます¹⁴。特に、合成されたRNAを欠いた赤血球を除去することは、サンプルを精製するために不可欠になります¹⁵。その後の細胞数の評価と死細胞の除去は、10x Genomics Gel bead-in Emulsion(GEM)の生成、バーコード化を成功させ、感受性の高い集団(好中球や上皮細胞など)の排除を危険にさらすことなく転写産物や配列決定された細胞の回収率を高めるための前提条件となります¹⁶。これらのステップは、腫瘍サンプル^9,10内のシングルセル分解能解析の可能性を解き放ち、革新的な治療介入を推進するために必要な新しい遺伝子発現プロファイルと免疫シグネチャーを明らかにし、新たな腫瘍の脆弱性を特定するための基本です。

プロトコル

この研究は、ヒト組織サンプリングに関するすべての機関ガイドラインに準拠していました。患者からインフォームドコンセントを受け取り、識別可能なサンプルデータを匿名化しました。手術室で検体を採取し、RPMI、生理食塩水、PBSのいずれかの溶液に入れ、病理部でがん性を確認した後、研究に使用します。指示されている場合を除き、すべてのステップは4°Cまたは氷上で実行する必要があります。ヒト組織を処理するときは、バイオセーフティフード内で作業します。このプロトコールで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。

1. サンプルの入手

1. 培地のチューブで固形腫瘍サンプルを採取し、氷の上に置きます。
   1. 手術室のスタッフに、サンプルの脱水を避けるために組織を完全に沈めるのに十分なRPMI、生理食塩水、またはPBSを含むチューブでサンプルを輸送するように指示します。
      注:サンプルが乾燥していないことを確認することは、生存率を低下させるため、重要です。
2. すべての遠心分離機を4°Cに冷却し、サーマルミキサーを37°Cにします。
3. 調製したヒトまたはマウスの腫瘍解離酵素(材料表)を取り出し、37°Cのサーマルミキサーで解凍し、解凍したら氷に移します。
4. RPMIの20mLアリコートを取り出します。
5. 関連するサンプル情報(患者ID、識別子解除、サンプルタイプなど)を記録します。
6. チューブを数回反転させ、内容物をディッシュに注ぎ、すべてのサンプル材料が移送されるようにして、サンプルを60 mm組織培養ディッシュ(氷上に置かれた)に移します。サンプルが到着時にメディアで配送されなかった場合は、新しいRPMIメディアを皿に追加します。
   1. サンプルが断片化している場合は、サンプルの入ったチューブを 450 × g で 4 °C で 5 分間回転させ、上清を捨て、サンプルを 420 μL の RPMI に再懸濁して、セクション 2 に移動します。

2. 機械的および酵素的消化

1. 60 mmサンプルディッシュから420 μLの培地を1.5 mLの微量遠心チューブにピペットで移します。メディアに懸濁したサンプルフラグメントを含めてみてください。
2. ピンセットを使用して、サンプル組織を60 mmディッシュから培地が入った1.5 mLチューブに移します。チューブ内の清潔なハサミでサンプルを切り取り、ピースの直径が最大2〜3mmになるようにします。
3. メーカーの仕様(材料表)に従って調製した消化酵素を、ヒトサンプル用に42 μLの酵素H(非特異的プロテアーゼ)、マウスサンプル用に酵素D(非特異的プロテアーゼ)、21 μLの酵素R(非特異的プロテアーゼ)、および5 μLの酵素A(ヌクレアーゼ)でサンプルに加えます。
4. ディッシュからさらに420 μLの培地、またはチューブの1 mLマークまで追加します。メディアが420μLを超えないようにしてください。
5. チューブを5秒間ボルテックスし、横向きに垂直に配置されたサーマルミキサーに入れます(図1B)。37°C、450 rpmで15分間インキュベートします。
   注:インキュベーション中は、GEMの生成に必要な10x Genomics材料をすべて取り出してください。これらは室温に平衡化するのに30分かかります

3.サンプルフィルタリング

1. 新しい15 mLコニカルチューブの上に50 μmセルフィルターを置き、1 mLの新鮮なRPMI培地をチューブに通してフィルターをプライミングします。
2. 分解後、1,000 μLのローリテンションワイドピペットチップを使用して、サンプルを15 mLチューブに移します。1.5 mLチューブを1 mLの新鮮な培地で洗浄し、培地をフィルターに移して、すべてのサンプル材料がフィルターを通過することを確認します。
3. 1 mLのプラスチック製シリンジを入手し、プランジャーだけを取り出します(シリンジの残りの部分は廃棄します)。シリンジプランジャーの背面を使用して、サンプルをフィルター上でひねる動きで粉砕して押します。
4. フィルターを5 mLの培地と、サンプル(セクション1)が含まれていたディッシュ(セクション1)の残りの培地で洗浄し、組織から剥離した可能性のある細胞を回収します。
5. 新しい15 mLコニカルチューブの上に30 μmセルフィルターを置き、1 mLの培地でフィルターをプライムし、解離したサンプルを含むチューブの内容物をフィルターを通して移します。
   注:このステップでは、10x Genomicsマイクロ流体チップを使用してサンプルを実行する際に詰まったり、濡れ不良を引き起こしたりする可能性のある大きな破片を取り除きます。

4.赤血球溶解

1. サンプルを450 × g、4°Cで5分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、メディアを吸引します。
2. ACK Lysisバッファーに再懸濁して赤血球(RBC)を除去し、使用した量を記録します。容量は、ペレットのサイズとペレット中のRBCの程度によって異なります。
   注:再懸濁されたACKサンプル溶液は、十分なACK溶解バッファーが追加されている場合、サンプルから赤血球が除去されるため、無色である必要があります。
3. サンプルチューブを450 × g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
4. 必要に応じて手順4.2〜4.3を繰り返し、遠心分離後にサンプルペレットの赤い色が見えなくなるまで繰り返します(図2)。この手順で使用した ACK Lysis バッファーの追加ボリュームを記録します。
5. カウントの準備として、サンプルペレットを新鮮な培地に再懸濁します。

5. 細胞計数

1. 10 μLのトリパンブルーを1.5 mLチューブに入れます。解離した細胞を穏やかに混合し、10 μLのサンプルを採取し、トリパンブルーと(1:1)混合します。血球計算盤の両側に10μLをロードし、細胞をカウントします。
2. 細胞濃度、総生細胞数、生存率、およびカウント後の最終培地量を記録します。
3. 最適な10x Genomicsランのためには、細胞数が700〜1,200細胞/μL(7×10⁵- 1.2 ×^{10 6}/mL)であることを確認してください。
   1. サンプルが濃縮されすぎている場合は、培地で希釈して再カウントします。
   2. サンプルが希釈されすぎている場合は、サンプルを450 × g、4°Cで5分間遠心分離し、少量の培地に再懸濁します。
   3. 細胞生存率が80%未満の場合は、死んだ細胞を取り除くための生死処置を行います。
   4. セルが 100 万個未満の場合は、セクション 6 を参照してください。
   5. 細胞が100万個以上あり、生存率が10%>場合は、セクション6を参照してください。
   6. 細胞が100万個以上あり、生存率が10%<場合は、セクション7を参照してください。
   7. 細胞生存率が80%を超える場合は、処理した細胞を氷上に保持し、製造元の指示に従ってすぐにGEM生成に進みます。

6. デッドセルの除去 - キット1

注:死細胞除去試薬を使用するときは、バイオセーフティフード内で作業してください。

1. サンプルを450 × g、4°Cで5分間遠心分離します。
2. 15 mLのコニカルチューブに単離培地を調製し、室温に保ちます:9.8 mLのPBS、10 μLのCaCl₂、および200 μLの熱不活化FCS(バイオセーフティフードに添加)。
3. 遠心分離後、ペレットから培地を吸引し、1 mLの単離培地に再懸濁します。
4. チューブを再度450 × g、4°Cで5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを100 μLの分離媒体に再懸濁します。
5. 分離培地中の100 μLのサンプルを0.2 mL PCRストリップチューブの1ウェルに移します。
6. バイオセーフティフードに、10 μLのAnnexin V Cocktailと10 μLのBiotin Selection Cocktailを、100 μLのサンプルを単離培地に封入したウェルに加えます。溶液をピペットで混合し、室温で4分間放置します。
7. 4分後、デキストラン被覆磁性粒子を30秒間ボルテックスします。20 μLのビーズと60 μLの分離培地をサンプルに加えます(総容量200 μL)。生存率が40%未満の場合は、アイソレーションメディアの容量(最大40μL)を調整しながらビーズの量を最大40μLまでスケールし、総容量を200μLに保ちます。
8. ストリップチューブを10x Genomics Magnetic Separator(高設定)に室温で5分間置きます。
9. ビーズを乱さずにストリップチューブから液体を新しい1.5mLローバインドマイクロ遠心チューブに移します。ストリップチューブを磁石から取り外さないでください。
10. サンプルを入れた1.5 mLチューブを450 × g、4°Cで5分間遠心分離します。上清を吸引し、セクション5で説明したように、ペレットのサイズと細胞数に基づいて、適切な容量のRPMI培地にペレットを再懸濁します。生存率が80%未満のままの場合は、死細胞の除去手順を繰り返します(図3 および 図4)。
    注:塩化カルシウムはカプセル化プロセスと逆転写(RT)ステップを妨害するため、下流のGEM生成のために細胞を分離培地に再懸濁しないでください。
11. 細胞生存率が80%を超える場合は、処理した細胞を氷上に保ち、メーカーの指示に従ってすぐにGEM生成に進みます。

7. デッドセルの除去 - キット2

注:キット試薬を使用するときは、バイオセーフティフード内で作業してください。

1. マイクロビーズと20x Binding Bufferストック溶液をバイオセーフティフードの中に入れます。
2. サンプル懸濁液を450 × g、4°Cで5分間遠心分離します。
3. 1 mLの20x Binding Bufferストック溶液を19 mLのDNAse-RNAseフリー蒸留水にピペットで移し、滅菌条件下で1x緩衝液を調製します。
4. 遠心分離が完了したら、上清を吸引し、マイクロビーズを加え、サンプルを穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートします。
   1. 細胞数が10⁷ 以下の場合は、マイクロビーズを100μL加えます。
   2. 合計細胞数が10⁷ 個を超える場合は^{、マイクロビーズ} を最終濃度10 μL/10 μLに調整します。
5. インキュベーション中に、MACSポジティブセレクションカラム1本、MACSマルチスタンド、および対応する磁気セパレーターを入手してください。磁力が強力で、デッドセルの除去効率に影響を与える可能性があるため、セパレーターがマルチスタンドで水平になり、他の金属や磁性物体がスタンドの近くにないことを確認してください。翼を外側に向けてカラムをセパレーターホルダーにぴったりと置きます。
6. サンプルインキュベーション後、総再懸濁量が500 μL未満の場合は、総容量が500 μLになるまで1x Binding Bufferを添加します。
7. 15 mLのコニカルチューブをカラムの下に置き、3 mLの1x Binding Bufferでカラムをプライムします。
8. コニカルチューブを細胞サンプル収集用の新しい15 mLコニカルに交換し、サンプルをカラムに追加して、サンプルがカラムを完全に流れるようにします。
9. 1x Binding Bufferのカラムを4 x 3 mLで洗浄し、前の洗浄液がカラム全体に流れた後、一度に1回の洗浄のみを加えます。
10. 4回目の洗浄後、単離された細胞を含む円錐管を450 × g、4°Cで5分間遠心分離します。カラムと残りの1xバインディングバッファーを廃棄します。
11. ペレットサイズに基づいて適切な量のRPMI培地にサンプル溶液を再懸濁し、セクション5(図3 および 図5)で説明されている方法を使用して単離された細胞をカウントします。
    1. 生存率が80%未満であり、細胞の総数が10⁶ 以下の場合は、セクション6を繰り返します。
    2. 細胞生存率が80%を超える場合は、処理した細胞を氷上に保管し、メーカーの指示に従ってすぐにGEM生成に進みます。

結果

RPMIに懸濁した黒色腫生検を採取し、直ちに氷上に置いた。サンプルを420 μLのRPMIおよび消化酵素が入った1.5 mLの微量遠心チューブに移し、ハサミで細かく刻み、その後、37°Cの垂直配置サーマルミキサーで15分間酵素分解を行いました(図1)。分解後、サンプルを50 μmの滅菌使い捨てフィルターでろ過し、フィルターを新鮮なRPMIで洗浄して細胞収量を増やしました(

ディスカッション

このプロトコルでは、10x Genomicsマイクロ流体システムを使用して、ヒトまたはマウスの腫瘍サンプルを単一細胞懸濁液に解離させ、scRNAシーケンシングを行う方法について説明します。希少がんに由来することが多い組織や、進行中の臨床試験やマウス腫瘍の長期実験の一部である組織の処理では、サンプルをすべてのステップ間で最適かつ慎重に保存する必要があります。室温で長時間の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C