マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発

要約

この研究では、最近作成されたダブルレポーター株を用いた マイコバクテリウム・アブセッサス に対するハイスループットスクリーニングのためのアッセイを開発し、蛍光と発光を使用して細菌の生存率を迅速に評価しました。このプロトコルは、この薬剤耐性菌に対する新薬のスクリーニングを目指す研究者に関連しています。

要約

マイコバクテリウム膿瘍 (Mab)感染症は、多剤耐性結核に匹敵する高い内因性薬剤耐性のため、治療が困難です。治療は非常に効果がなく、多剤併用療法に基づいているため、患者のコンプライアンスは低くなります。したがって、科学界は、これらの感染症を治療するための新しく効果的な薬を特定することが求められています。この目的のために採用された戦略の1つは、ドラッグリパーパシング、つまり、市場に出回っている既存の医薬品の新しい治療機会を特定し、新薬の薬物動態および安全性プロファイルを確立するために必要な時間を回避するプロセスです。Mabに対する医薬品開発に関するほとんどの研究は、従来型で時間のかかる方法に依存しているため、マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイは、 自社 開発のMabのダブルレポーター株を使用して開発されました。リキッドハンドリングロボット、自動顕微鏡、分析、および 自社 開発のダブルレポーター株を使用して、試薬を追加したり余分な手順を実行したりすることなく、発光と蛍光の2つの異なる読み出しを使用して細菌の生存率を迅速に測定できます。これにより、アッセイ間の時間とばらつきが減り、ハイスループットスクリーニングの大きな利点となります。記載されたプロトコールは、1280化合物のライブラリーをスクリーニングすることによりバリデーションされました。得られた結果は、活性化合物の効率的な検出により、文献によって裏付けられました。したがって、この研究は、この非常に薬剤耐性のある細菌と戦うのに役立つ新しいツールをフィールドに供給するという目的を達成しました。

概要

マイコバクテリウム・アブセッサス(Mab)は、特に嚢胞性線維症やその他の肺疾患を持つ人々の肺感染症の原因となる日和見病原体です。マブによって引き起こされる感染症は、多剤耐性結核に匹敵する絶妙な内因性薬剤耐性があるため、治療が難しいことで有名^です1。利用可能な薬剤は、非常に不透過性のマイコバクテリア細胞エンベロープと、抗生物質を不活性化するいくつかの酵素をコードするゲノムのために、ほとんど効果がありません²。したがって、治療には、数か月から数年かかるいくつかの薬物の組み合わせが含まれます。この困難な多剤併用レジメンと低い患者コンプライアンスの組み合わせにより、平均治癒率は30%から50%になります³。さらに、非結核性抗酸菌によって引き起こされる肺感染症の有病率は、Mab ^1,4によって引き起こされるものを含め、過去数十年にわたって増加しています。その結果、科学界はマブ感染症を治療するための新しい化合物の開発を急いでいます。

この目的で追求される戦略の1つが、ドラッグリパーパシング(既存薬の新たな治療機会を特定するプロセス)です。これにより、新薬の発見と開発のパイプラインに伴う最大の課題であるタイム⁵を回避できます。このシンプルなコンセプトは、いくつかの医薬品のすでに確立された薬物動態および安全性プロファイルを利用して、開発コストを削減し、医薬品をベンチから^{ベッドサイド6}まで取得するのにかかる時間を短縮します。したがって、数百から数千のそのような化合物を組み合わせたライブラリがまとめられており、研究者は目的の病原体に対して薬物を再利用する可能性を迅速にテストすることができます。

Mabに対する医薬品開発に関するほとんどの研究は、マイコバクテリアに対する化合物の in vitro 活性を評価するゴールドスタンダードでありながら伝統的なアッセイに基づいています-コロニー形成単位^は7を数えます。その精度にもかかわらず、この手順は非常に時間がかかり、誰かが何千もの化合物を含むライブラリをテストすることを目指すと、すぐに実行不可能になります。この目的のために、ハイスループットスクリーニング(HTS)が医薬品開発に統合され、ロボティクスとリキッドハンドリングデバイスを活用した堅牢なアッセイにより、数千の化合物を並行して迅速にスクリーニングできるようになりました⁸。これは通常、96ウェル、384ウェル、1536ウェル、または3456ウェルフォーマットのマイクロタイタープレートを使用して、最初に単一の濃度をテストすることによって行われ、ヒットを特定し、それらをさらにパイプラインに最適化して臨床的に使用するための出発点として機能します。

レポーターベースのアッセイは、他の色素および吸光度ベースのアッセイ^7,9と比較して、その簡便性と感度により、HTSの堅牢性に大きな利点を提供します。しかし、私たちの知る限り、Mab⁹に対するハイスループットスクリーニングを最適化した研究はごくわずかです。

最近、当研究室では、発光と蛍光を併発するダブルレポーター株を開発しました¹⁰。マブoperon_mScarletはそのような菌株の1つです。これは、細菌のルシフェラーゼ(luxAB遺伝子の発現による)と長鎖アルデヒド基質(luxCDE遺伝子の発現による)を含むLuxABCDEオペロンの発現により自己発光します。一方、蛍光読み出しは、最近開発された赤色蛍光タンパク質mScarletの発現によって得られ、これはより一般的に使用されるeGFPおよびmCherryタンパク質を凌駕し、より強力なシグナルを提供する¹¹。この菌株を用いることで、試薬の追加や追加ステップを行わずに、マイクロプレートリーダーで発光シグナルを測定することで、液状培養中の細菌生存率を評価することができます。検出に関しては、固有蛍光により、色素や抗体を使用せずに、生細胞または固定細胞の顕微鏡での視覚化が可能になります。1つの株が両方の読み出しを持つことで、研究者はHTSアッセイで使用する際に大きな利点を得ることができます - 異なる読み出しを持つアッセイ間のばらつきが減少し、アッセイの性質に基づいて株を交換する必要がないためです。

したがって、この研究では、自社で設計されたダブルレポーター株を使用して、Mabに対するハイスループットアッセイを開発しました(図1)。これにより、市販のライブラリーを使用して、転用を目的としたin vitro活性1280薬剤を迅速に評価することができました(資料表を参照)。第一に、活性は発光性を用いたブロス培養アッセイで評価され、第二に、蛍光シグナルを利用してMabに感染したマクロファージを使用することにより、in vivoで見られる感染プロセスをよりよくエミュレートした¹²。

図1:確立されたプロトコルのグラフィカルな要約。 このスクリーニングの主役は、 自社開発の ダブルレポーターマイコバクテリア株であり、すべての実験で使用されています。まず、試薬ディスペンサーとプランクトン性細菌を使用して、化合物を単一濃度で試験することにより、初期スクリーニングを行います。同定されたヒットはバリデーションアッセイに進み、3つの異なる濃度が試験されます。どちらの実験も発光読み出しを使用して行われます。検証されたヒットは感染アッセイに進み、3つの異なる濃度もテストされ、骨髄由来マクロファージがMOI 1で感染します。ハイコンテントイメージングシステムが細菌の蛍光シグナルを取得し、解析ソフトウェアを使用してMycoloadフォーミュラによる細胞内負荷を評価します。アッセイの複雑さが増すと、化合物の数は減少します。BioRender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

すべての動物実験は、i3Sの地域動物倫理委員会によって承認され、欧州理事会指令(2010/63/EU)および実験に関する動物福祉に関するポルトガルの法律(DL 113/2013)に従って、ポルトガル当局の食品獣医学総局(DGAV)によって認可されました。

1. Z'因子評価

注:HTSアッセイの性能を評価するために、いくつかのパラメータを決定できます。最もよく使用されるパラメータは、Z素因数(Z'因子)です。この指標は、特定の実験の統計的効果サイズを測定し、正のコントロールとネガティブコントロールがどの程度適切に分離されているかを示します。Z'因子が0.5から1の範囲の場合、両方の集団間の分離は優れており、これらの条件をHTSアッセイで使用できます。Z'<0.5の場合、分離はわずかであり、スクリーニング¹³を行うことは推奨されません。そのため、プレートの半分を未処理のバクテリアで、残りの半分をポジティブコントロールで使用してZ'係数を計算する実験が設計されました(補足図1)。

1. アッセイの2〜3日前に、三角フラスコの液体増殖培地(約1 x 10⁷ CFU/mL)に細菌を接種して、Mabの培養前を調製します。バクテリアをインキュベーター内で37°Cで増殖させ、攪拌(90 rpm)します。
   注意:マブ培養物を扱う場合は、バイオセーフティキャビネットが必要です。
2. Mab precultureの成長を、分光光度計を使用して600 nmの光学密度測定で追跡します。培養物が指数関数的な成長段階に達したら、ステップ1.3に進みます。
3. 指数関数的前培養を使用して、液体増殖培地中に約5 x 10⁵ CFU/mL(光学密度値と相関)¹⁴ の細菌懸濁液を調製します。
4. 液体成長培地中の細菌増殖阻害のポジティブコントロール溶液を調製する。このアッセイでは、ポジティブコントロールはクラリスロマイシン(DMSOで10 mg/mL)、4 μg/mLでした。クラリスロマイシンは、所望の最終濃度の2倍に調製する必要があります。.
5. 小型カセットを装備したマイクロプレート試薬ディスペンサーを使用して、15 μL の液体増殖培地を黒色のポリプロピレン製 384 ウェルプレートのブランクカラムおよび未処理カラムに分注します。ブランクカラムには、さらに15 μLの液体増殖培地を分注します。
   注:ブランクカラムは、37°Cでの内部ウェルの蒸発を防ぎます。
6. 小型カセットを装備したマイクロプレート試薬ディスペンサーを使用して、ステップ1.4で調製したポジティブコントロール溶液15 μLをポジティブコントロールカラムに分注します。
7. 大型カセットを装備したマイクロプレート試薬ディスペンサーで、ステップ 1.3 で調製した細菌懸濁液 15 μL をブランクを除くすべてのカラムに分注し、すべてを 1:2 に希釈します。すべての384ウェルの最終容量は30μLです。
   注:マイクロプレート試薬ディスペンサーには、チューブサイズ(それぞれ0.5mmと0.22mm)が異なる大型または小型のカセットを装備できます。チューブシステム内の細菌の凝集を防ぐために、より大きなカセットを使用することが望ましいですが、液体の浪費が増えます。それにもかかわらず、アッセイ全体を通して同じカセットを使用することができます。
8. 各プレートをプレートシーラーでシールし、連続的なガス交換を可能にします。インキュベーター内で37°Cで、湿潤チャンバー内で攪拌せずに48時間インキュベートします。
9. 48時間後、各プレート内の細菌が放出する発光を、積分時間を1秒のプレートリーダーで読み取ります。
10. Z'因子を決定するには、手順1.9で取得した値を使用して、正のコントロール(AVG_P およびSD_P)と負のコントロール(AVG_N およびSD_N)の平均偏差と標準偏差を計算します。その後、次の式を適用します。
    注:3 x SDは一般的に使用されるしきい値です。ただし、標準偏差を掛ける係数を増減することで、スクリーニングにより適するように調整できます。

2. ヒット作のライブラリースクリーニング

注:最初のスクリーニングは、液体培養で増殖する細菌に対して実施されました。このセットアップは、最終容量が 30 μL の 384 ウェルプレート用に設計されました。各プレートには、ブランクウェル(液体増殖培地のみ)、ネガティブコントロール(未処理のバクテリア)、および溶媒コントロール(バクテリアと化合物の溶媒-この場合はDMSO; 補足図2)。化合物または溶媒を所望の最終濃度の2倍でプレートに添加し、細菌を1:1に添加しました(すべてを半分に希釈しました)。

1. ステップ1.1から1.3の説明に従って細菌懸濁液を調製します。
   注意:マブ培養物を扱う場合は、バイオセーフティキャビネットが必要です。
2. 液体成長培地に溶媒溶液を調製します。溶媒の量は、目的の最終濃度の2倍である必要があります。
3. 小型カセットを装備したマイクロプレート試薬ディスペンサーを使用して、溶媒コントロールカラムを除く黒色ポリプロピレン製384ウェルプレートの各カラムに15 μLの液体増殖培地を分注します。ブランクカラムの場合は、さらに15 μLの液体増殖培地を分注します。
4. 小型カセットを装備したマイクロプレート試薬ディスペンサーで、あらかじめ調製した溶媒溶液15 μLを溶媒コントロールカラムに分注します。
5. リキッドハンドラーを使用して、ストック 96 ウェルプレート(DMSO で 1 mM)の化合物 200 nL を 384 ウェルプレートに移します(ブランク、溶媒制御、および未処理カラムを除く)。化合物の濃度は現在13.3μMです。
6. 大型カセットを装備したマイクロプレート試薬ディスペンサーで、ステップ 2.1 で調製した細菌懸濁液 15 μL をブランクを除くすべてのカラムに分注し、すべてを 1:2 に希釈します。384ウェルすべての最終容量は30 μLで、各化合物は6.66 μMです。
7. 各プレートをプレートシーラーでシールし、連続的なガス交換を可能にします。
   注:アッセイは通常の蓋で行うことができます。ただし、エッジ効果が強くなる可能性が高くなります。
8. インキュベーター内で37°Cで、湿潤チャンバー内で攪拌せずに48時間インキュベートします。
9. 48時間後、各プレート内の細菌が放出する発光を、積分時間を1秒のプレートリーダーで読み取ります。

3. ヒットスクリーニングデータ解析

注:取得した発光データでヒットを同定するには、化合物が溶解する溶媒に値を正規化し、溶解した場合は384マイクロタイタープレートで検証されたエッジ効果に正規化する必要があります。

1. ステップ 2.9 で取得したデータの溶媒正規化のために、各ウェルの相対光単位(RLU)を溶媒コントロールウェル(対応するプレート内)の平均 RLU で除算します。このアッセイでは、スクリーニングプレートの中央に向かって強いエッジ効果が確認されました。したがって、そのためにすべてのデータを正規化することが決定されました。これを達成するために、このプロセスは以下で説明するように2段階で行われました。
   1. ステップ 3.1 で取得した値を、ヒット数を除く対応する位置のすべてのプレート (プレート 1 - P1、プレート 2 - P2、プレート 3 - P3、プレート 4 - P4) で除算して、エッジ効果マスクを作成します。たとえば、A1 と A2 のポジションの場合、Mask_A1 = 平均 (P1_A1;P2_A1;P3_A1;P4_A1);Mask_A2 = 平均 (P1_A2;P2_A2;P4_A2)[P3_A2がヒットしたため除外されました]。
   2. 手順3.1で取得した値を除算します。ステップ3.1.1で取得したエッジエフェクトマスクによって。たとえば、 です。その後、各プレートのAVGとSDを計算して、各プレートのしきい値(AVG±3SD)を設定します。この閾値を超える化合物はヒットとみなされ、ヒットバリデーションアッセイに進みます。

4. ヒットバリデーションアッセイ

注:ヒットを特定したら、異なる濃度を使用して検証する必要があります。バリデーションアッセイでは、同じコントロールで同様のセットアップを使用しますが、各ヒットは1:2の段階希釈の対象となります。このアッセイでは、13.3 μM、6.66 μM、3.3 μMの3つの濃度を使用しました。溶媒コントロールには、各化合物ウェルと同じ溶媒%が含まれています(補足図3)。

1. ステップ1.1から1.3の説明に従って細菌懸濁液を調製します。
   注意:マブ培養物を扱う場合は、バイオセーフティキャビネットが必要です。
2. 小型カセットを装備したマイクロプレート試薬ディスペンサーを使用して、黒色のポリプロピレン製384ウェルプレートの各カラムに15 μLの液体増殖培地を分注します。ブランクウェルの場合は、15 μLの液体増殖培地を追加で最初と最後のカラムに分注します。
3. マイクロプレート試薬ディスペンサーを使用して、各化合物の最高[μM]を含むカラムに追加の15 μLの液体増殖培地を分注します。
4. ストック96ウェルプレートから、ステップ4.3から各ヒットの0.8μL(DMSOで1 mM)をそれぞれのウェルに手動でピペットで移します。化合物の濃度は現在26.6μMです。
5. 0.8 μLの溶媒をコントロールウェルに手動でピペットで入れます(ステップ4.4と同じ)。
6. マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、各化合物と溶媒コントロールに対して2回の1:2段階希釈を行います。最後の段階希釈後、15μLを超えるものは廃棄してください。現在、すべてのウェルの濃度は15μLで、化合物の濃度は26.6μM、13.3μM、6.66μMです。
7. 大型カセット付きのマイクロプレート試薬ディスペンサーを使用して、4.1で調製した細菌懸濁液15 μLをすべてのカラム(ブランクウェルを除く)に分注し、化合物を1:2に希釈します。すべてのウェルの最終容量は30μLで、各化合物は13.3μM、6.66μM、および3.3μMです。
8. プレートをプレートシーラーでシールし、連続的なガス交換を可能にします。インキュベーター内で37°Cで、湿潤チャンバー内で攪拌せずに48時間インキュベートします。
9. 48時間後、プレートリーダーを使用して、各プレート内の細菌が放出する発光を1秒の積分時間で読み取ります。

5. 感染アッセイ

注:Mabは細胞内通性病原体であるため、感染アッセイではヒットの抗菌活性と宿主毒性を決定する必要があります。そのために、骨髄由来マクロファージ(BMM)をMabに感染させ、ステップ4で検証されたヒットを異なる濃度で処理しました。各アッセイには、ブランク(水のみ)、ネガティブコントロール(未処理の感染マクロファージ)、ポジティブコントロール(有効な抗生物質で処理された感染マクロファージ)、溶媒コントロール(この場合はDMSO)、および試験対象の化合物を13.3 μM、6.66 μM、3.3 μMの3つの濃度で使用しました(補足図4)。

1. 前述の¹⁵のように、野生型成体マウス(BALB/cまたはC57BL/6)のマウス骨髄からマクロファージを誘導する。96ウェルの黒色で光学的に透明な平底プレートに細胞を2 x 10⁵ 細胞/mL、ウェルあたり200 μLでプレートします。37°C、7%CO₂¹⁵で10日間の分化後、細胞は感染して治療を進める準備ができています。
   注:骨髄由来マクロファージを得るためのプロトコルは十分に確立されています¹⁵。ただし、このスクリーニングプロトコルは、RAW 264.7、THP-1、およびPBMC由来マクロファージなどの他の細胞にも適応できます。
2. ステップ1.1から1.3で説明したように細菌懸濁液を調製し、細胞培養培地中の細菌懸濁液を多重感染(MOI)1の感染に合わせて調整します。
   注意:マブ培養物を扱う場合は、バイオセーフティキャビネットが必要です。
3. ウェルの補充した細胞培養培地を、ガラスピペットに取り付けられた真空ポンプを使用して慎重に吸引します。このステップは、細胞の剥離を防ぐために、ゆっくりと簡単に実行する必要があります。
4. ステップ5.2で調製した細菌懸濁液75μLを各ウェルに手動でピペットで移します。プレートを7% CO₂ と共に37°Cで細胞インキュベーター内で4時間インキュベートします。
5. 細胞処理用の化合物を調製します。小型カセットを装備したマイクロプレート試薬ディスペンサーを使用して、ポリプロピレン製丸底96ウェルプレート、110 μLの添加細胞培養培地を、化合物または溶媒制御を行うカラムに分注します(補足図4)。
6. マイクロプレート試薬ディスペンサーを使用して、添加した細胞培養培地104 μLを追加で、化合物または溶媒の濃度が最も高いカラムに分注します。
7. 5.9 μLの化合物(DMSOで1 mM)または溶媒を指定されたウェル(ステップ5.6のカラム)に手動でピペットで移します。化合物の濃度は現在26.6μMです。
8. マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、化合物と溶媒ごとに1:2の段階希釈を2回行います。110μLを超えるものは、最後の段階希釈後に廃棄してください。現在、すべてのウェルの濃度は110 μLで、化合物の濃度は26.6 μM、13.3 μM、および6.66 μMです。
9. マイクロプレート試薬ディスペンサーを使用して、補充した細胞培養培地110 μLをすべてのカラム(ブランクウェルを除く)に分注します。現在、すべてのウェルの濃度は 220 μL で、化合物の濃度は 13.3 μM、6.66 μM、および 3.3 μM です。
10. クラリスロマイシン(ポジティブコントロール)の溶液を2 μg/mLで調製します。
11. ステップ 5.4 の 4 時間後、プレートワッシャーを使用して、感染した 96 ウェルプレートを 200 μL の感染洗浄液で 3 回洗浄します。吸引速度と分注速度を可能な限り遅く保ち、細胞の剥離を防ぎます。
12. 最終吸引後、ステップ5.5-5.9で調製した化合物200μLを、感染したマクロファージを含む96ウェルプレートに移します。
13. 200 μLの補充した細胞培養培地を未処理のウェルに移します。ステップ5.10で調製したクラリスロマイシン溶液200μLをそれぞれのウェルに移します。
14. プレートを細胞インキュベーター内で37°C、7%_CO2と共に48時間インキュベートします。
15. 48時間後、コンパウンドの洗浄液(ウェルあたり200μLで3倍)でプレートワッシャーを使用して、感染した96ウェルプレートを洗浄します。
16. マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、200 μLの固定溶液をすべてのウェルに分注し、10分間作用させます。
17. 固定後、プレートワッシャーを使用して、化合物の洗浄液(ウェルあたり200μLで3回)で細胞を洗浄します。
    注:プロトコルはここで一時停止できます。細胞は、汚染と細胞の乾燥が防止されれば、化合物の洗浄液に4°Cで数日または数週間保存できます。コンパウンドの洗浄液は、ステップ5.18の前に吸引する必要があります。
18. マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、200 μLの透過化溶液をすべてのウェルに分注し、15分間作用させます。プレートワッシャーを使用して、透過化溶液を吸引します。
19. マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、100 μLの染色溶液を手動で分注し、プレートを室温で30分間インキュベートします。
20. プレートワッシャーを使用して、コンパウンドの洗浄液(ウェルあたり200μLで3倍)でプレートを洗浄します。最後に、染色した細胞を化合物の洗浄液に残します。
21. 以下の設定で、ハイコンテントイメージングシステムでプレートをスクリーニングします。
    対物レンズ:20x Air/0.4NA(96マイクロタイタープレートの1ウェル、57視野(FOV)
    モード:共焦点
    DAPI(核)用のレーザー405nm
    レーザー 561 nm (mScarlet) (バクテリア)
    レーザー 640 nm HCS Cell Mask Deep Red (cytoplasm)
    zスタックなし
    注:細胞は広視野イメージングシステムでイメージングできるため、解像度が低下します。
22. 画像取得のための機器ハンドリングロボットを夜間にセットアップします。このロボットアームは、人間の介入なしにハイコンテントイメージングシステムのプレートを交換します。
    注: これは必須ではありません。プレートは手動で交換できます。

6. 画像解析

注:画像解析は、画像の取得に使用されるハイコンテントイメージングシステムと同じ解析ソフトウェアを使用して実行されます。分析パイプラインは、サンプル画像を使用して作成する必要があります (補足図 5)。その後、ウェル全体(57 FOV)とデータセット(すべてのプレート)に適用されます。解析ソフトウェアは、さまざまな関心領域(核、細胞質、細胞、細菌)のセグメンテーションから始まり、それらを関連付け(細胞内の細菌など)、次に形態学的および強度特性(面積、強度など)を抽出するという論理的な一連のステップをたどります。画像解析の基本的な手順を以下に説明します。使用される完全なプロトコルは、 補足図5に記載されています。

1. DAPIシグナルを使用して核を、DeepRedシグナルを使用して細胞質を、mScarletシグナルを使用して細菌をセグメント化します。
2. 核と細胞質のセグメンテーションを関連付けて、細胞のマスクを作成します。
3. すべての境界線オブジェクトを削除します。FOV でフルとして表示されるセルのみが (セル全体) と見なされます。
4. 全細胞と細菌を関連付けることにより、全細胞内の出力集団細菌を定義します。
5. 感染した全細胞を複数の細菌領域を持つものと定義し、感染していない全細胞を1個未満の細菌領域を持つものと定義する。
6. すべての関心領域がセグメント化され、人口が作成されたら、それらのプロパティを計算して抽出します。ウェルごとに次のプロパティが抽出されます。
   1. 全細胞用/感染全細胞/非感染全細胞、抽出物
      細胞数(ウェルあたりの合計)
      面積 [μm²] (ウェルあたりの平均 + 標準偏差)
      幅と長さのセル比(ウェルあたりの平均+標準偏差)
   2. 全細胞の細菌については、抽出物
      同定された細菌領域の数(ウェルあたりの合計)
      強度(各領域の平均強度のウェルあたりの合計)
      地域の面積(井戸当たりの合計)
7. データをエクスポートしてスプレッドシートでキュレーションした後、次の式に従って細胞内負荷(Mycoload)を定量化します。
   

結果

Z'因子評価
図2は、Z'因子を計算するために実行された2つの実験のうちの1つのデータを示しています。ポジティブコントロールはクラリスロマイシンで、4 μg/mLでした。どちらの実験でも、Z'係数は0.64と0.62であり、このアッセイに使用した条件と読み出しを、その後のスクリーニングアッセイに適用できることを意味しています(Z' > 0.5)。それにもかかわらず、Z'因子は、各実験のパフォーマンスを制御するために、残りのすべての実験(感染アッセイ)について計算されました。

設計されたHTSアッセイの概念実証として、薬物再利用を目的とした化合物のライブラリーが試験されました。1280種類の多様な低分子で構成されており、その95%はFDAとEMAの両方の承認薬です。これらの分子は、化学的および薬理学的多様性が高いです。

図2:Z'因子評価結果。 2.5 x 10⁵ CFU/mL の Mab を、クラリスロマイシンの有無にかかわらず、4 μg/mL で 37 °C で 48 時間インキュベートしました。 インキュベーション期間後、マイコバクテリアの生存率を評価するために発光を測定しました。このグラフは、1つの独立した実験における、処理された生存率の高いマイコバクテリアと未処理の生存率マイコバクテリアの個々の発光値を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ヒット作のライブラリースクリーニング
すべての化合物を Mab に対して 6.66 μM で試験しました。ライブラリーのサイズにより、化合物は4つの異なるマイクロタイター384ウェルプレートに分割されました(図3A-D)。結果は、溶媒と検証済みのエッジ効果の両方について正規化しました。

このスクリーニングアッセイでは、33のヒットが同定され、そのうち30は発光発光が大幅に減少し、マイコバクテリアの生存率が低下しました(図3)。興味深いことに、3つの化合物が発光発光の増加につながり、細菌の代謝や増殖の増加に関連している可能性があります(図3)。このプロファイルが維持されるかどうかをテストするために、発光を増加させた3つの化合物を含む33のヒットすべてがバリデーションアッセイに持ち込まれました。

図3:ライブラリースクリーニング結果 (A-D) Mab 2.5 x 10⁵ CFUs/mL を 1280 化合物と 6.66 μM で 48 時間、37 °C でインキュベートしました。 インキュベーション後、発光を測定してマイコバクテリアの生存率を評価しました。グラフは、1つの独立した実験のRLUを示しており、溶媒およびエッジ効果の正規化後に任意の単位として示されています。AVG RLUとそれに対応するSDは、しきい値を決定するために各プレートについて計算されました(灰色;AVG±3SD)です。丸い記号は、テスト済みの化合物を表します。青色では、そのしきい値を超える化合物はヒットと見なされます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ヒットバリデーションアッセイ
このアッセイに使用した濃度は、13.3 μM、6.66 μM、および3.3 μMでした。各化合物は、堅牢性を高めるために重複して試験されました。

重要なことに、化合物30、31、および32は、以前はRLUが高いと関連していました(図3A、C)がこのプロファイルを維持し、化合物32で処理したウェルでマイコバクテリアの生存率が200%以上を達成しました(図4)。

化合物20および33は、試験したすべての濃度でマイコバクテリアの生存率がほぼ100%であったため、不活性と判断されました(図4)。

化合物9と21は、最も低い2つの濃度で同様の不活性を示しました。ただし、20とは対照的に、それらは最高値である13.3μMで活性を維持し、化合物21はより高い効力を示します(図4)。

化合物3も、化合物21よりも小さいものの、最低濃度で不活性を示し、6.66μMで活性損失を示します(図4)。最も低い濃度でのみ、化合物2、7、8、10、16、18、24、および28は、より低い治療可能性を示しました。しかし、2、10、28でもマイコバクテリアの生存率は<50%です。

世界的に、残りの14の化合物は、試験したすべての濃度で活性を示しました。

図4:ヒットバリデーションアッセイの結果。 2.5 × 10⁵ CFUs/mLのMabを、13.3 μM、6.66 μM、および3.3 μM(それぞれDMSOの1.3%、0.7%、0.3%)で同定した各ヒットでインキュベートし、37°Cで48時間インキュベートしました。 インキュベーション期間後、マイコバクテリアの生存率を評価するために発光を測定しました。このグラフは、1つの独立した実験で、処理された生存率と未処理の抗酸菌の割合を示しており、各化合物は重複して試験されています。丸い記号は、各コンパウンドの重複を表します。バーは、これらの重複の平均を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

感染アッセイ
試験した33の化合物のうち、28が感染アッセイに選ばれました(図4)。化合物7、8、9、20、および33は、このアッセイには選択されませんでした。9、20、33は検証時に非アクティブだったため除外されましたが(図4)、最初の2つは技術的な理由により除外されました。それにもかかわらず、これらの化合物は、リファンピシンおよびリネゾリドとして同定され、すでにマブ感染症の治療に使用されている抗生物質^である12。感染アッセイで試験したすべての化合物が同定され、 表1にリストされています。Mabに感染したマクロファージに対する化合物の抗菌活性は、細菌の固有蛍光を読み取り値として使用して評価しました。

化合物	名前	化合物	名前
1	スルファチアゾール	18	セフロキシム
2	シプロフロキサシン	19	リファキシミン
3	セフォタキシム	21	セフディニル
4	ダウノルビシン	22	クラリスロマイシン
5	ドキソルビシン	23	ベシフロキサシン
6	チオストレプトン	24	レボフロキサシン
10	アミカシン	25	リファブチン
11	モキサラクタム	26	ガチフロキサシン
12	スルファメチゾール	27	エピルビシン
13	スルファモノメトキシン	28	パモ酸ピルビニウム
14	セフォキシチン	29	モキシフロキサシン
15	ノボビオシン	30	トロレアンドマイシン
16	セフメタゾール	31	リンコマイシン
17	ロキシスロマイシン	32	スピラマイシン

表1:感染アッセイで試験された化合物のリスト。 ステップ4で検証した化合物を感染アッセイ(ステップ5)で試験しました。

Mabに感染したマクロファージに対する化合物の毒性は、最初に評価されたパラメータでした。化合物を毒性または非毒性と見なすために設定された閾値は、生存可能なマクロファージの85%でした(図5)。試験された28の化合物のうち、4、5、6、27、および28が有毒と見なされました。(図 5)。したがって、これらの5つの化合物は、次のマクロファジー内活性評価から除外されました。

図5:Mab感染マクロファージに対するHitsの毒性。 BALB/cマウスBMMをMab(MOI=1)に感染させ、13.3 μM、6.66 μM、および3.3 μM(それぞれDMSOの1.3%、0.7%、0.3%)で以前に同定された各ヒットで、37°C、7% CO₂で48時間インキュベートしました。細胞は、細胞生存率を測定するために核数(DAPIで染色)を使用して、ハイコンテントスクリーニング蛍光顕微鏡でイメージングされました。このグラフは、2つの独立した実験の生存可能な未治療の感染マクロファージに対する、生存可能な治療された感染マクロファージの割合を示しています。丸い記号は、各アッセイにおける細胞の生存率を表しています。棒は、2つの独立した実験の平均を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞内Mabに対する残りの23種類の化合物のマクロファージー内活性を推測するために(図6)、Mycoload式(ステップ6で前述)を使用して、未処理の感染マクロファージに正規化されたマイコバクテリアの生存率を求めました。ほとんどの化合物は、ヒットバリデーションアッセイ(図4)と比較して、内在化マイコバクテリア(図6)に対する治療の可能性を失いました。これは、最高試験濃度でヒット数が25から6に減少したためです。驚くべきことに、プランクトン性マブの生存率を非処理細菌と比較して増加させた3つの化合物(30、31、および32;図3および図4)は、細胞内Mabに対する抗マイコバクテリア活性を示し、化合物30および32は、DMSOと比較した場合、化合物32の場合でも3.3μMの有意な統計的差を示しました(図6)。化合物 11 および 23 で処理したマイコバクテリアは、13.3 μM で <50% の生存率を示しました。ただし、これはDMSO制御と大きな違いはありませんでした(図6)。化合物21、26、および29は、13.3 μMで有意な統計的差を正当化するのに十分な効力を示し、29が最も活性を示しました(図6)。最後に、化合物17、22、および25は、内在化マイコバクテリアに対して試験されたすべての濃度で非常に強力でした。これらは、それぞれロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、およびリファブチンとして同定されました(表1)。3つの化合物のうち、クラリスロマイシンはMabに対して最も活性が高く、マイコバクテリアの生存率は10%を超えることはなく、DMSOと比較して、試験したすべての濃度でp値<0.0001を示しました(図6)。

図6:Mabに感染したマクロファージに対するHitsのマクロファージ内活性。 BALB/cマウスBMMをMab(MOI=1)に感染させ、13.3、6.66、および3.3μM(それぞれDMSOの1.3、0.7、および0.3%)で以前に同定された各ヒットでインキュベートし、37°C、7%_CO2で48時間インキュベートしました。細胞をハイコンテントスクリーニング蛍光顕微鏡でイメージングし、蛍光シグナルを使用してMycoloadを計算しました(ステップ6を参照)。このグラフは、2つの独立した実験で、未治療の感染マクロファージと比較した、治療された感染マクロファージに見られるMycoloadの割合を示しています。統計は、Dunnetの多重比較検定と二元配置分散分析を使用して実行されました。*、p < 0.05;**、p < 0.01;、p < 0.001;、pこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:Z'因子評価で使用した384ウェルプレートレイアウトの例。 ホワイト - ブランクウェル(液体成長培地のみ)。黄色 - ポジティブコントロール(抗生物質で処理された細菌)。赤 - ネガティブコントロール(未処理の細菌)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:ライブラリースクリーニングで使用した384ウェルプレートレイアウトの例。 ホワイト - ブランクウェル(液体成長培地のみ)。緑 - 溶剤制御;赤 - ネガティブコントロール(未処理の細菌)。青 - スクリーニングする化合物。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:ヒットバリデーションに使用した384ウェルプレートレイアウトの例。 ホワイト - ブランクウェル(液体成長培地のみ)。緑 - 溶剤制御(重複)。赤 - ネガティブコントロール(未処理の細菌)。青 - スクリーニングする化合物(重複)。色あせた色は1:2の段階希釈を表します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:感染アッセイに使用される96ウェルプレートレイアウトの例。 白 - ブランクウェル(蒸発を防ぐための水)。赤 - ネガティブコントロール(未処理マクロファージ);黄色 - ポジティブコントロール(抗生物質で処理されたマクロファージ)。緑 - 溶剤制御;青 - テスト対象の化合物。色あせた色は1:2の段階希釈を表します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図5:画像解析プロトコル。 この研究では、画像分析の詳細なプロトコルが使用されており、オープンソースソフトウェアに適合させることができます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、 自社開発株¹⁰におけるMabに対する薬物スクリーニングパイプラインについて記述している。リキッドハンドリングロボット、自動顕微鏡検査と分析、およびダブルレポーター株を使用して、試薬を追加したり余分な手順を実行したりすることなく、発光または蛍光を使用して細菌の生存率を迅速に評価します。このアプローチにより、アッセイ間の時間とばらつきが減り、HTSアッセイの目的を考える上で大きな利点となります。

何千もの化合物をスクリーニングする場合、効果的な薬剤を簡単に特定する必要があります。この目的のために、Z'因子は、アッセイの性能を推測する統計的効果サイズを測定するためによく使用されます。Z'因子が0.5>場合、試験条件は、処理された集団と未処理の集団を区別するのに最適である¹³。試験した条件では、Z'因子>0.6(図2)が得られ、スクリーニングキャンペーンに適用できることが統計的に証明されました。このステップは、スクリーニングの有効性を確保するために重要です。

そこで、浮遊性に増殖するMabに対する数千種類の化合物の抗菌活性を検出するためのHTSプロトコルが開発されました。Mabは細胞内通性病原体であるため、設計されたプロトコルは、同じ細菌株に対する細胞内抗菌活性もスクリーニングします-これは重要な利点です。さらに、宿主細胞に対する毒性も評価できます。したがって、Mab に対する薬物スクリーニングへの多段階のアプローチが説明されており、さまざまな実験設定を使用して抗菌活性と細胞毒性を評価し、成功の可能性を高めます。概念実証として、1280の化合物からなる化学ライブラリーをスクリーニングしました。

合計33のヒットが特定されました(図3)。そのうち、3つは液体培養におけるマイコバクテリアの生存率を有意に増加させました(化合物30、31、および32;図 3 と図 4)。これらの化合物は、細菌の生存率に影響を与えることなく発光発光を妨害する可能性があることに注意する必要があります。内在化マイコバクテリアに対して試験したところ、これらの化合物は抗菌活性を示し(図6)、宿主細胞の内在化後にMabに対してより高い有効性を示しました。これらの化合物は、トロレアンドマイシン(30)、スピラマイシン(32)、およびリンコマイシン(31;表 1)。前者の2つは、マイコバクテリア感染症の治療に使用される抗生物質の一種であるマクロライド¹⁶であり、後者は、マクロライド¹⁷と同様の作用機序を持つ抗生物質であるリンコサミドである。マブは、液体および固体の培養物の両方で、別のリンコサミドであるクリンダマイシンに対して特に耐性があることが報告されています¹⁸。それにもかかわらず、免疫調節および抗炎症特性はマクロライド^19,20およびリンコサミド²¹と関連しており、これは、内在化マイコバクテリアに対する抗菌活性の増加を説明する可能性があります(図6)。

残りの30回のヒットのうち、11回のヒットは、すべての濃度でマイコバクテリアの生存率を>90%低下させます(図4)。一般的なHTSアッセイの予想ヒット率が~1%²²であることを考えると、開発されたプロトコルは通常観察されるものと一致しています。それにもかかわらず、他のいくつかの化合物はまだ活性があり、28の化合物が感染アッセイに進みました。

同定された化合物のうち、ダウノルビシン(4)、ドキソルビシン(5)、エピルビシン(27)、チオストレプトン(6)、およびパモ酸ピルビニウム(28;表 1)。最初の3つは抗腫瘍剤23,24,25であるため、当然のことながら、このアッセイで使用される哺乳動物細胞に対して毒性があります。パモ酸ピルビニウムは、効果的な駆虫薬として長年使用されてきました。しかし、2004年以降、それは反腫瘍活動とも関連している²⁶。最後に、チオストレプトンは獣医学でよく使用されるオリゴペプチドであり、ヒトでの使用は承認されていません²⁷。乳がん細胞に対するこの薬剤の活性は報告されています²⁸。チオストレプトンのマクロファジー内活性は、骨髄由来マクロファージに対する毒性のため評価されませんでした(図5)。しかし、チオストレプトンはMabに感染したTHP-1細胞に対して5μMで有効であることが示されている²⁹。プランクトン性細菌²⁹に対する報告された結果は、このスクリーニングで得られた結果と同様であり、チオストレプトンは非常に強力です(図4)。

マクロファジー内活性についてスクリーニングされたほとんどの化合物は、治療の可能性を示さなかった(図6)。細菌の細胞内増殖は、プランクトン培養とは大きく異なります。後者では、細菌と薬物との直接接触が常に可能です。前者では、宿主細胞による内在化により、いくつかの宿主膜が、薬物が標的に到達するために転置する必要がある物理的な障壁として機能し、ほとんどのヒットの抗菌活性の低下を説明するのに役立ちます。最高濃度の13.3μMでは、セフジニル(21)、ガチフロキサシン(26)、モキシフロキサシン(29;表 1)。モキシフロキサシンはすでに第二選択の抗結核薬^{として使用されていますが16}、セフジニルは肺炎³⁰などのいくつかの気道細菌感染症の治療に一般的に使用されています。しかし、結核菌³¹およびマブに対するその活性が報告されており、後者³²に対するカルバペネムとの強力な相乗効果を示しています。ガチフロキサシンはフルオロキノロンであり、その活性は過去^33,34にいくつかのマイコバクテリアに対して報告されています。このアッセイで最も活性の高い3つの化合物(図6)は、ロキシスロマイシン(17)、クラリスロマイシン(22)、およびリファブチン(25;表1)は、すべての濃度で非常に強力です。最初の2つはマクロライド類であるのに対し、リファブチンはリファマイシンであり、両方のクラスが多くのマイコバクテリア感染症に対する治療の基礎として機能しています¹⁶。

このスクリーニングは、アッセイ間のばらつきを減らすために、特定の高価なリキッドハンドリング装置に依存しています。非常に再現性が高いにもかかわらず、リキッドハンドラーには、音響的なもののような化合物の非接触転写がありません。したがって、特定の付着性化合物は、転写間で金属ピンに付着したままになり、後続のウェルに持ち越され、スクリーニング段階で偽陽性が発生する可能性があります-これが化合物33で起こったことでした。そのため、スクリーニングの検証は、その成功にとって非常に重要であり、偽陽性が薬物スクリーニングパイプラインの次のステップに進むことがないようにします。感染アッセイでは、共焦点モードを備えたハイコンテントイメージングシステムを使用して、細菌領域の可能な限り最高の定義を取得します。それにもかかわらず、共焦点モードなしで使用することは可能ですが、定義が失われ、細菌領域の同定が妨げられる可能性があります。このプロトコルは、イメージングシステムに統合されたシンプルでユーザーフレンドリーな解析ソフトウェアを利用しています。ただし、オープンソースソフトウェアはプロトコルに従って使用できます(補足図5)。結局のところ、マブ感染症の治療に薬剤を転用していないにもかかわらず、これらの結果は確立されたプロトコルを検証し、より大きなライブラリーに拡張できるため、非常に重要です。重要なことは、このプロトコルは、蛍光または発光性の測定値が利用可能であれば、あらゆる細菌に適応できると私たちは信じています。このように、この研究は創薬分野に大きく貢献し、最大の公衆衛生問題の1つである抗生物質耐性菌、特にほとんど難治性の病原体であるマイコバクテリウム・アブセッサスと戦うために必要なツールを提供しています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin	Bio Optica	05-01005Q	fixation solution
384-well black round bottom polypropylene not treated microplate	Corning	3658	White microplates can be used; polystyrene can be used
50 TS Washer	BioTek
Breathe-Easy sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z380059-1PAK
cell::explorer	Revvity		equipment handling robot
Clarithromycin	Sigma-Aldrich	A3487-100MG	Dissolved in DMSO to the desired concentration
DMSO	Fisher Scientific	D/4121/PB15	Dilute in liquid growth medium to the desired concentration
Harmony 5.1	Revvity		analysis software
Heracell VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific		cell incubator
JANUS with 4 Tip Arm and MDT Arm	Revvity		liquid handler
KB 8182	Termaks		incubator with agitation
Libra S4+	Biochrom
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Opera Phenix Plus	Revvity		imaging system
PhenoPlate	Revvity	6055302	Necessary for high-content microscopes
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1x	NA	NA	washing solution
Prestwick Chemical libraries			Commercial chemical library intended for drug repurposing
Shaking incubator 3031	GFL
VICTOR Nivo	Revvity
Cell culture medium:			When needed, add 10% of supplement
DMEM	Gibco	10938-025
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biowest	S1810
HEPES Buffer Solution (1 M)	Gibco	15630-056
LCCM	NA	NA	Conditioned media from L929 cell line that releases Macrophage colony stimulating factor (M-CSF); cell culture medium supplement
L-glutamin (200 mM)	Thermo Scientific	25030024
Sodium Pyruvate 100 mM (100X)	Gibco	11360-039
Infection washing solution
Apirogenic water			Multiple suppliers available
Hank's Balanced Salt Solution 10x	Gibco	14060-040	Dilute to 1x with apirogenic water
Permeabilising Solution			PBS with 0.1% Triton X100
PBS 1x	NA	NA
Triton X100	Sigma-Aldrich	T8787	Other suppliers available
Staining solution			PBS with DAPI (500 ng/mL) and HCS Far Red (10 ng/mL)
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
HCS Far Red	Invitrogen	H32721
PBS 1x	NA	NA	Multiple suppliers available
Liquid growth medium			When needed, add 10% supplement
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310
Tween80	Sigma-Aldrich	P4780	0.05% final concentration. Other suppliers available
Liquid growth medium supplement:
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9702-100
D-Glucose anhydrous	Fisher Scientific	G/0450/60