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要約

このプロトコルは、シリコン、ナイロン縫合糸、およびシリンジ針を使用して、マウスの中大脳動脈閉塞(MCAO)モデル用のコーティングフィラメントを作成するための簡単な方法を説明しています。この方法により、実験的なニーズに合わせた一貫した直径とさまざまなシリコーンラッピング長さのフィラメントを製造することができます。

要約

世界人口の高齢化が進む中、虚血性脳卒中は世界で2番目に多い障害と死亡の原因となり、社会と家族の両方に多大な負担をかけています。静脈内血栓溶解療法や血管内インターベンションなどの治療は、急性虚血性脳卒中の患者の転帰を大幅に改善することができますが、これらの治療の恩恵を受ける個人はごく一部です。この疾患の理解を深め、より効果的な治療法を発見するために、研究者は動物モデルを継続的に開発し、改良しています。その中でも、脳血管疾患の研究で最も一般的に使用されているモデルとして、中大脳動脈閉塞術(MCAO)モデルが際立っています。このモデルで使用されるフィラメントは、その開発にとって非常に重要です。このプロトコルは、一貫した直径とさまざまな長さのシリコーンコーティングを備えたフィラメントを作成する方法を概説しています。この方法を使用してC57マウスで作製したMCAOモデルは、高い成功率と一貫性を示しており、虚血性脳血管疾患のテーラーメイド研究のための貴重なツールを提供しています。

概要

脳卒中は、世界中で最も一般的な死亡と障害の原因の1つです。虚血性脳卒中および出血性脳卒中は脳血管イベントの主なタイプであり、虚血性脳卒中が症例の約87%を占めています1,2,3。現在、虚血性脳卒中患者には、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子 (rtPA) による薬理学的療法と機械的血栓摘出術の 2 つの治療法があります。しかし、治療期間が狭く、除外基準が広範囲にわたるため、これらの治療法の適用は制限され、利益をもたらす患者はごくわずかです。このことは、虚血性脳卒中治療を改善するための継続的な努力の必要性を強調しています4,5。In vitroモデルは、脳卒中後の複雑な病態生理学的応答を再現するには不十分であり、動物モデルは脳卒中前研究に不可欠な要素となっています。ヒトの限局性脳虚血は、中大脳動脈 (MCA) の血栓性または塞栓性閉塞によって最も頻繁に引き起こされるため、MCA 閉塞 (MCAO) をシミュレートするように設計されたげっ歯類モデルは非常に関連性があります6.

脳卒中研究で最も広く採用されているフィラメント誘発MCAOモデルは、中大脳動脈(MCA)の発症時の閉塞とその後の再灌流を促進し、脳の皮質下領域と皮質領域全体に広範な梗塞を引き起こします。このモデルの利点は、局所虚血を誘発した後に血流を回復させる能力にあり、それによってヒトの脳卒中で観察される病態生理学的プロセスと並行しています7。さらに、このモデルは、損傷の程度の重要な要素である再灌流損傷をシミュレートします8。ただし、MCAOモデルには、梗塞体積のばらつきなどの制限があり、一部の研究では標準偏差が平均値の最大64%に達する可能性があります9。30年以上の使用にもかかわらず、モデルの信頼性を高めるための努力は進行中であるが、虚血性病変の体積の有意な変動は、研究および実験室間で持続している10,11,12。

本稿では、神経学的欠損スコアと脳梗塞領域を評価するモデルを誘導するための自己作製フィラメントについて紹介します。シリコーンでコーティングされたフィラメントの長さと、MCAOモデルの成功と安定性との間の相関関係を調べます。この製造技術により、称賛に値する一貫性を持つフィラメントが得られ、比較的安定したMCAOモデルの開発に貢献しています。

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プロトコル

すべての動物処置は、山西省人民病院施設動物管理および使用委員会(承認番号:2024年省医療倫理委員会第64号)によって承認された実験手順と基準を遵守しました。この実験で使用したマウスは、8〜10週齢の雄C57BL/6マウスで、体重は24〜26gでした。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. フィラメントの準備

  1. 元のフィラメントにマーキングする:6-0ナイロン縫合糸をプラスチック製の定規プレートに均等に巻き付けます。フィラメントヘッドから5mmと10mmのところに印を付けます(コーティングマークポイントと挿入深さマークポイントを含む)。
  2. 両端が完全に円形になるようにブレードで垂直に下向きに切断すると、最初の長さ2cmのフィラメントが得られます(図1)。
  3. コーティング装置の製作:止血鉗子を使用して26Gシリンジの針頭をスナップオフし、次にサンドペーパーで針穴を完全な円に磨きます。10 mKシリンジで2 mLのK-704シリコーンシーラントを引き上げ、最後にニードルヘッドをシリンジに取り付けます。
  4. フィラメントのコーティング:最初のフィラメントを、準備した針穴にマークされた5mmまたは10mmの位置まで挿入します。実体顕微鏡でフィラメントが完全にコーティングされるまで、シリンジをゆっくりと着実に押します(図2)。
  5. コーティングされたフィラメントのセット:コーティングされたフィラメントを粘着テープで直立させ、シリコンが完全に固まるまで約20分待ちます。
  6. 滅菌と包装:準備したフィラメントを75%アルコールに浸し、綿棒で拭いて乾かしてから、5mLの遠心分離チューブに包装します。

2. MCAOモデル

注:手術器具はオートクレーブ(121°C、15psi、60分間)により滅菌しました。手術台やその他の機器は、75%エタノールを使用して消毒されました。マウスは術前に8時間絶食されましたが、水への自由なアクセスが許可されました。

  1. 手術の60分前に鎮痛のために5 mg / kgのメロキシカムを皮下投与します。.麻酔中はマウスの体温を37°Cに維持するために、ヒートブランケットを接続します。
  2. 自発的な動きとひげのけいれんが止まるまで 4% イソフルランで麻酔を誘発し、麻酔を 1.5% に維持します (施設で承認されたプロトコルに従います)。両目に目の軟膏を塗ります。
  3. マウスを仰臥位に置き、頭と手足を固定し、首と胸の上部の毛を剃り、皮膚を75%エタノールで内側から外側に消毒します。
  4. 下顎から胸骨まで、首の正中線に沿って2.5cmの長さの皮膚切開を行います。
  5. 右首の筋肉を鈍く解剖して頸動脈鞘を露出させます。眼科用鉗子を使用して鞘を開き、総頸動脈(CCA)、外頸動脈(ECA)、および内頸動脈(ICA)を分離し、迷走神経を乱さないように注意します。
  6. 分岐する前にCCAをスリップノットで一時的に結紮し、ICAを顕微手術動脈クランプでクランプします。
  7. バイポーラ凝固ペンを使用して、ECAから上甲状腺動脈を焼灼します。
  8. 結紮のためにECAに2本の糸を残します:1つは永久的な結紮のために遠位端に、もう1つは近位端に将来の使用のために緩い結び目で。ECAの2つの結紮糸の間に、眼ハサミでフィラメントを挿入し、約0.5mmの切開を行います。
  9. 5mmまたは10mmのシリコンコーティングされたフィラメントを切開部からCCAに挿入し、緩い結び目を締めて固定します。
  10. ECAの遠位端を切り取り、クランプをICAから取り外した後、フィラメントをCCA分岐部まで引っ込めます。次に、抵抗を感じるまでフィラメントを反転させて深部ICAに進めます。フィラメントを少し引き抜き、結び目を締めて固定します。
  11. 動物の皮膚を3-0縫合糸で縫合し、傷口をヨウ素で消毒します。マウスを回収チャンバーに1時間置きます。
  12. マウスに再度麻酔をかけ、フィラメントを静かに取り外し、フィラメントを固定しているECA結紮糸を結び、CCAスリップノットを解放して血流を回復させ、中大脳動脈を再灌流します。
  13. 余分な糸を切り取り、首の皮膚を縫合し、その部分をもう一度消毒します。

3. 偽装運転

  1. 偽手術の場合は、7 mm のシリコンコーティングされたフィラメントを挿入して右中大脳動脈を閉塞し、すぐに引き抜いて即時の再灌流を可能にします。
    注:その後の手順は、脳虚血を受けている動物に対して行われる手順と同じです。

4.ニューロスコア

  1. 各群の実験動物をオープンフィールドに配置し、脳虚血再灌流の4時間後に行動術後スコアリングを行います。
  2. モデリングを成功させるには、1 から 3 の間のスコアを考慮してください。評価基準は、表1に詳述されているように、ロンガスコアリング方法10に基づいています。
  3. 修正神経重症度スコア (mNSS)13 に従って神経学的欠損を評価し、再灌流後 24 時間および 72 時間後に評価を行います ( 表 2 を参照)。

5. 経心灌流

  1. マウスを 1.5% ペントバルビタールナトリウムで麻酔します (施設で承認されたプロトコルに従います)。マウスをケージに戻し、10分間待ちます。次に、マウスのつま先をつまんで反射神経の欠如をテストし、深い麻酔を確認します。
  2. マウスをフォームスタンドの仰臥位に置き、手足を固定します。
  3. 25Gの針の先端を切り取って鈍くし、大動脈壁の穿刺を防ぎます。針を20mLの生理食塩水で満たされたシリンジに接続します。
  4. 胸部の毛皮を持ち上げ、はさみを使って皮膚を切り取り、剣状突起を露出させます。剣状突起をつかみ、その下に水平に切り込み、筋肉層を開いて横隔膜を露出させます。横隔膜をハサミで慎重に切り、心臓への損傷を避けます。
  5. 胸骨の外側に沿って切開して両側の胸郭を開き、胸郭の前壁を反転させて止血剤で固定します。
  6. 綿棒を使用して心臓の基部の脂肪を取り除き、大動脈の根元を露出させます。
  7. 鉗子で心臓を固定し、心臓の頂点に針を挿入し、大動脈壁を通して針が見えるまで斜め上に進みます。clamp 針を所定の位置に固定します。
  8. 右心房に小さな切り込みを入れて血流を観察します。シリンジで生理食塩水を着実に灌流し、血液が右心房から出るのを監視します。廃液が澄んだら、灌流14を停止します。
  9. 灌流後、マウスの首を切って脳15 を採取し、さらなる処理のために-20°Cの冷凍庫に入れる。

6. TTC染色による梗塞量の評価

  1. 調達した脳組織を-20°Cの冷凍庫で20分間急速凍結した後、予め冷やした脳スライス型に載せて1mmの厚さに切片化します。
  2. 得られた脳切片を2%TTC溶液に浸し、37°Cで20分間インキュベートします。
  3. 脳のスライスを4%パラホルムアルデヒドに一晩浸し、翌日写真を撮ります。
  4. ImageJを使用して、各スライスの梗塞領域と脳全体の領域を測定します。梗塞体積比は、次の式を使用して計算します:梗塞体積率=(梗塞領域の合計/脳全体の領域の合計)×100%。

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結果

MCAOモデルの作成では、フィラメントと完成したフィラメントの製造に使用される主なツールを 図3に示します。フィラメント製造後、外頸動脈からフィラメントを挿入することによりMCAOモデルが確立され、手術時間が記録されます。モデリングの成功は、フィラメント抜去後4時間後のロンガスコアが1〜3であることで定義されます。手術後、?...

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ディスカッション

この研究は、フィラメントを製造するためのシンプルで費用対効果の高い方法を示し、MCAOモデルの作成におけるその実現可能性を確認します。フィラメントのシリコンコートの長さは、実験的なニーズに応じて調整でき、柔軟性が増します。5 mm フィラメント塞栓の調製は、マウスでくも膜下出血 (SAH) の発生なしに 100% の成功率を達成しました。10mmフィラメント塞?...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、Wu Jieping Medical Foundation(320.6750.161290)の支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL SyringeHaidike Medical Products Co., Ltd.Instrument for making filaments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)Sigma-AldrichG3005Dye for TTC staining
24-well culture plateCorning CLS3527Vessel for TTC staining
26 G syringe needleHaidike Medical Products Co., Ltd.Instrument for making filaments
4% paraformaldehydeServicebioG1101Tissue fixation
6-0 nylon sutureHaidike Medical Products Co., Ltd.Materials for making filaments
Anesthesia system for isofluraneRwd Life Science Co., Ltd.R610 Anesthetized animal
Bipolar electrocoagulation generatorYirun Medical Instrument Co., Ltd.ZG300Equipment for surgery
Constant temperature water bathSpring  Instrument Co., Ltd.HH-M6TTC staining
Eye ointmentGuangzhou PharmaceuticalH44023098Material for surgery
Heat blanketZH Biomedical Instrument Co., Ltd.Maintain body temperatur 
IsofluraneRwd Life Science Co., Ltd.R510-22-10Anesthetized animal
MeloxicamBoehringer-IngelheimJ20160020Analgesia for animal
Microsurgical artery clampShanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd. W40130Instrument for surgery
Microsurgical hemostatic clamp forcepsShanghai Jinzhong Surgical Instruments Co., Ltd. M-W-0022Instrument for surgery
Microsurgical instruments setRwd Life Science Co., Ltd.SP0009-REquipment for surgery
Mouse thermometerHubei Dasjiaer BiotechnologyFT3400Intraoperative temperature monitoring
Pentobarbital sodiumSigma-AldrichP3761Euthanized animal
ShaverJoyu Electrical AppliancesPHC-920Equipment for surgery
Silicone SealantKafuterK-704Materials for making filaments
StereomicroscopeRwd Life Science Co., Ltd.77001SEquipment for surgery
Suture thread with needle (3-0)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. F404SUS302Equipment for surgery

参考文献

  1. Collaborators GBDS. Global, regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: A systematic analysis for the global burden of disease study 2019. Lancet Neurol. 20 (10), 795-820 (2021).
  2. Kleindorfer, D. O., et al. Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  3. Saini, V., Guada, L., Yavagal, D. R. Global epidemiology of stroke and access to acute ischemic stroke interventions. Neurology. 97 (20 Suppl 2), S6-S16 (2021).
  4. Hill, M. D., Coutts, S. B. Alteplase in acute ischaemic stroke: The need for speed. Lancet. 384 (9958), 1904-1906 (2014).
  5. Asif, K. S., et al. Mechanical thrombectomy global access for stroke (mt-glass): A mission thrombectomy (mt-2020 plus) study. Circulation. 147 (16), 1208-1220 (2023).
  6. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  7. Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).
  8. Shaik, N. F., Regan, R. F., Naik, U. P. Platelets as drivers of ischemia/reperfusion injury after stroke. Blood Adv. 5 (5), 1576-1584 (2021).
  9. Zhang, S. R., et al. Large-scale multivariate analysis to interrogate an animal model of stroke: Novel insights into poststroke pathology. Stroke. 52 (11), 3661-3669 (2021).
  10. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  11. Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 174 (1), 18-24 (2008).
  12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in c57bl/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  13. Bieber, M., et al. Validity and reliability of neurological scores in mice exposed to middle cerebral artery occlusion. Stroke. 50 (10), 2875-2882 (2019).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  15. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
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