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要約

このプロトコルでは、MultiBac Baculovirusシステムを使用してヒトミオシン-7aホロ酵素を組換えで生成する手順と、調整されたin vitroフィラメントグライディングアッセイを使用してその運動性を研究する手順について詳しく説明します。

要約

ミオシン-7aは、聴覚および視覚プロセスに不可欠なアクチンベースのモータータンパク質です。ミオシン-7aの変異は、ヒトの聴覚障害者失明の最も一般的で重篤な形態であるアッシャー症候群1型につながります。ミオシン-7aは、他のアッシャータンパク質と膜貫通接着複合体を形成し、視細胞および蝸牛有毛細胞の構造機能的完全性に不可欠であると仮定されています。しかし、純粋で無傷のタンパク質を得ることは困難であるため、ヒトミオシン-7aの正確な機能メカニズムは依然としてとらえどころがなく、利用可能な構造的および生体力学的研究は限られています。近年の研究により、哺乳類のミオシン-7aは、重鎖と3種類の軽鎖(調節性軽鎖(RLC)、カルモジュリン、カルモジュリン様タンパク質4(CALML4)からなる多量体モーター複合体であることが明らかになっています。カルモジュリンとは異なり、CALML4はカルシウムイオンに結合しません。カルシウム感受性カルモジュリンと非感受性カルモジュリンの両方が、哺乳類のミオシン-7aの機械的特性を適切に微調整するために重要です。ここでは、MultiBac Baculovirusタンパク質発現系を用いて組換えヒトミオシン-7aホロザイムを作製する詳細な方法について述べる。これにより、ミリグラム量の高純度完全長タンパク質が得られ、その生化学的および生物物理学的特性評価が可能になります。さらに、調整された in vitro 運動アッセイと蛍光顕微鏡を使用して、その機械的特性と運動特性を評価するためのプロトコルを提示します。無傷のヒトミオシン-7aタンパク質の利用可能性は、ここで説明した詳細な機能特性評価プロトコルとともに、視覚および聴覚におけるミオシン-7aの分子的側面のさらなる研究への道を開きます。

概要

ミオシンは、アクチンと相互作用して多数の細胞プロセスを推進する分子モータータンパク質です1,2,3,4。ヒトは12のクラスと39のミオシン遺伝子5を持っており、これらは筋収縮6や感覚過程7などの幅広い生理機能に関与しています。各ミオシン分子は、重鎖と軽鎖からなる多量体錯体です。重いチェーンは、頭、首、尾の領域に分かれています。頭部には、ATPの加水分解とアクチンフィラメント2への力の生成に関与するアクチン結合部位とヌクレオチド結合部位が含まれています。ネックは、特定の光鎖のセットが結合されたいくつかのαヘリカルIQモチーフによって形成されています。それらは一緒になって、モーターのコンフォメーション変化を大きな動きに増幅するレバーアームとして機能します8,9,10

プロトコル

注:ここでは、インタクトなヒトミオシン-7aホロ酵素を合成し、その運動性をin vitroで特徴付けるためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは3つのセクションに分かれています:まず、MultiBacバキュロウイルスタンパク質発現システムを使用してヒトミオシン-7aを発現します。第二に、 大腸菌 His6-SUMOシステムを使用してミオシン-7a軽鎖を別々に精製します。そして最後に、アクチンフィラメントグライディングアッセイを使用してヒトミオシン-7aの運動性を研究します。

1. MultiBacシステムベースのミオシン-7a複合体の作製

  1. ヒトミオシン-7a複合体を発現するバキュロウイルス多重遺伝子カセットの作製(16日間)
    注:ミオシン-7aサブユニットのcDNAをpACEBac1ベクターに挿入するには1回のクローニングサイクル(4日)、ミオシン-7a複合体の発現に必要なすべての増殖モジュールの段階的なライゲーションを完了するには3回のクローニングサイクルが必要であり、合計16日かかります。
    1. 市販のキットを使用して、 ミオシン-7a重鎖(HC)、カルモジュリン、CALML4、 および RLC をコードするcDNAをpACEBac1ベクターにクローニングします(

代表的な結果

精製されたミオシン-7a複合体および軽鎖タンパク質は、 図3に示すように、SDS-PAGEゲル電気泳動によって評価できます。200 kDaマーカーの上のバンドは、ミオシン-7a重鎖(255 kDa)に対応します。22 kDaマーカーと14 kDaマーカーの間を上から下に移動する3つのバンドは、それぞれRLC(20 kDa)、カルモジュリン、およびCALML4です。カルモジュリンとCALML4の分?.......

ディスカッション

ここでは、昆虫細胞から組換えヒトミオシン-7aタンパク質を産生するための詳細なプロトコールを示します。Sf9/バキュロウイルス系は、種々のミオシン40,41,42,43を産生するために使用されてきたが、哺乳類のミオシン-7aがMultiBacバキュロウイルス系を用いて精製されたのはごく最近のこと?.......

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

画像解析に関するディスカッションと支援を提供してくださったウェストバージニア大学のMicroscopy Imaging FacilityおよびVisual Function and Morphology Coreに感謝します。この取り組みは、ウェストバージニア大学医学部からR.L.へのテニュアトラックスタートアップ資金によってサポートされています。この研究は、国立総合医科学研究所(NIGMS)のVisual Sciences Center of Biomedical Research Excellence(Vs-CoBRE)(P20GM144230)、およびNIGMSウェストバージニア州生物医学研究優秀ネットワーク(WV-INBRE)(P20GM103434)によってもサポートされています。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL microcentrifuge tubesVWR87003-294
1X FLAG PeptideGenScriptN/ACustom peptide synthesis
22x22mm No. 1.5 coverslipsVWR48366-227
250 mL Conical Centrifuge TubesNunc376814
250 mL Vented Erlenmyer Shaker FlaskIntelixBioDBJ-SF250VP
2-MercaptoethanolVWRM131
75x25x1 mm Vistavision microscope slidesVWR16004-42
Actin Protein (>99% Pure)CytoskeletonAKL99
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC510024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220
ATPMillipore SigmaA7699
ATPMillipore SigmaA7699
Bio-Spin Disposable Chromatography ColumnBio-Rad732-6008
BL21 Competent E. coliNew England BiolabsC2530H
Bluo-GalThermo Fisher15519028
Bovine Serum AlbuminMillipore Sigma5470
BstXI EnzymeNew England BiolabsR0113S
CalmodulinMillipore Sigma208694
CatalaseMillipore SigmaC40
Champion pET-SUMO Expression SystemThermo FisherK30001
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche Diagnostics5056489001
Cutsmart BufferNew England BiolabsB6004S
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DNase I, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-610-304
Double-Sided TapeOffice Depot909955
EGTA, Molecular Biology GradeMillipore Sigma324626-25GM
EGTA, Molecular Biology GradeMillipore Sigma324626-25GM
EthanolThermo FisherBP2818
ExpiFectamine Sf Transfection ReagentGibcoA38915
FAST programhttp://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; 
Fisherbrand Model 505 Sonic DismembratorFisher ScientificFB505110
Gentamicin Reagent SolutionGibco15710-06410 mg/mL in distilled water
GlucoseMillipore SigmaG5767
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
GlycerolInvitrogen15514-011
HisPur Cobalt ResinThermo Fisher89966
I-CeuI EnzymeNew England BiolabsR0699S
Image Stabilizer Pluginhttps://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
ImidazoleMillipore SigmaI2399
In-Fusion Snap Assembly Master MixTaKaRa638948
IPTGThermo Fisher15529019
IsopropanolFisher ScientificA451SK
KanamycinFisher ScientificAAJ67354AD
Large Orifice Pipet TipsFisher Scientific02-707-1341-200uL
LB Agar, Ready-Made PowderThermo FisherJ75851-A1
Leupeptin Protease InhibitorThermo Fisher78435
Magnesium chlorideThermo FisherJ61014.=E1M
Magnesium chlorideThermo FisherJ61014.=E1M
Max Efficiency DH10Bac Competent CellsGibco10361012
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
Microcentrifuge Tubes, 1.7mLVWR87003-294
MicroscopeNikonModel: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100X TIRF objective
Microscope CameraORCA-Fusion BT
Microscope Laser UnitAndor iXon Ultra
Miller's LB BrothCorning46-050-CM
MOPSMillipore SigmaM3183
MOPSMillipore SigmaM3183
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo FisherND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo FisherND-ONE-W
NEB 5-alpha Competent E.coli (High Efficiency)New England BiolabsC2987H
NEBuffer r3.1New England BiolabsB6003S
NIS ElementsNikon
NIS-ElementsNikon
NitrocelluloseLADD Research Industries53152
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco31985070
pACEBac1 VectorGeneva Biotech
ParafilmMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)QIAGEN28104
Quick CIPNew England BiolabsM0525S
Rhodamine phalloidinInvitrogenR415
S.O.C. MediumInvitrogen15544034
SENP2 proteasePMID:17591783Purified in the lab
Sf9 cellsThermo Fisher11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media CompleteGibco12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mLThermo FisherA52971
Sodium chlorideMillipore SigmaS7653
Sodium chlorideMillipore SigmaS7653
Stericup Quick Release Vacuum Driven Disposable Filtration SystemMillipore SigmaS2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
T4 DNA Ligase Buffer - 10X with 10mM ATPNew England BiolabsB0202A
Tetracycline HydrochlorideMillipore SigmaT7660-5G
TrisMillipore Sigma10708976001
Triton XAmerican Bioanalytical9002-93-1

参考文献

  1. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. J Cell Sci. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  2. Sellers, J. R. Myosins: a diverse superfamily. Biochim Biophys Acta. 1496 (1), 3-22 (2000).
  3. Titus, M. A.

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