コンピュータビジョンライブラリを使用して核の定量を効率化

要約

この記事では、さまざまな細胞密度で検証されたオープンソースの実行可能プログラムを使用して、画像ベースの核定量を自動化する方法を段階的に説明します。このプログラムは、コスト、技術的なスキルセットが限られているユーザーのアクセシビリティ、および既存のテクノロジーの有用性を制限する可能性のあるアプリケーション固有の検証に関連する障壁に対処する代替手段を提供します。

要約

生細胞アッセイや画像ベースの細胞解析では、正確な解釈のためにデータの正規化が必要です。一般的に使用される方法は、核を染色して定量し、その後、データを核数に正規化することです。この核数は、多くの場合、単核細胞の細胞数として表されます。手動による定量化は面倒で時間がかかる場合がありますが、利用可能な自動化方法はすべてのユーザーに好まれるわけではなく、この特定のアプリケーションに対する検証が不足している場合や、コストがかかりすぎる場合があります。ここでは、蛍光DNA染色で染色された核の定量化可能な画像をキャプチャし、Pythonコンピュータビジョンライブラリを使用して開発された自動オブジェクトカウントソフトウェアプログラムを使用して核を定量するためのステップバイステップの手順を説明します。また、このプログラムは、さまざまな細胞密度で検証されています。プログラムの実行の正確な時間は、画像の数とコンピューターハードウェアによって異なりますが、このプログラムは、核を数える作業時間をプログラムの実行時間を秒数に統合します。このプロトコールは、固定された染色細胞の画像を使用して開発されましたが、生細胞の染色された核の画像や免疫蛍光アプリケーションも、このプログラムを使用して定量化できます。最終的に、このプログラムは、高度な技術スキルを必要としないオプションを提供し、細胞生物学者や分子生物学者がワークフローを合理化し、面倒で時間のかかる核定量化のタスクを自動化するための検証済みのオープンソースの代替手段です。

概要

機能的および画像ベースの実験は、実験的処理が全細胞の生化学および生理学に及ぼす影響を理解するために重要です。細胞生物学実験のデータの有効な解釈は、データの標準化を含む実験プロトコルの精度と再現性に依存します。例えば、ベースライン時および特定の薬物による治療後の生細胞内の酸素消費量と細胞外酸性化速度の分析により、エネルギー代謝のさまざまな側面の評価が可能になります^1,2。細胞培養の上清中の乳酸デヒドロゲナーゼなどの酵素の活性を測定することは、細胞膜の完全性を定量化するのに役立ちます³。培養細胞を固定前にアネキシンVとヨウ化プロピジウムで染色すると、アポトーシス細胞と壊死細胞の評価が可能になります⁴。ただし、ウェル間の細胞密度の違いは、これらの各アッセイの結果に影響を与えます。播種密度のみに依存すると、播種用の細胞数計数の誤り、プレーティング中の培地中の細胞密度のばらつき、または実験中のサンプル間または処理間で細胞増殖速度が異なるため、誤解を招く結果をもたらす可能性があります。そのため、実験結果の正規化が必要です。

機能的および画像ベースの細胞データに対する現在の正規化方法には、タンパク質濃度⁵、核または細胞数⁶などがあります。データをタンパク質濃度に正規化するには、アッセイの実行後にプロテアーゼ阻害剤を含む等量の溶解バッファーで細胞を抽出し、タンパク質定量のために追加のアッセイ(ビシンコニン酸アッセイ、ブラッドフォードアッセイなど)を実施する必要があります。この方法の精度は、完全な細胞抽出に依存しています。タンパク質を放置すると、定量ミスの一因となります。核または細胞のカウントは、細胞が成長する表面から細胞を除去する必要がない代替手段を提供します。代わりに、生細胞または固定細胞を比色染色または蛍光染色を使用して染色または対比染色し、細胞全体または核のみの画像に基づいてカウントを行うことができます。核の定量化は、蛍光顕微鏡のアプリケーションや、融合細胞(筋管など)や組織のデータの標準化に、全細胞よりも好まれます。蛍光アプローチを用いた核の定量には、蛍光DNA色素(例えば、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩化物(DAPI)、Hoechst 33342、Hoechst 33358、DRAQ5など)を生細胞または固定細胞に適用し、蛍光顕微鏡を用いてイメージングします。DAPI、Hoechst、およびDRAQ5は^、DNA7,8,9のアデニン-チミンに富む領域に優先的に結合し、核を検出する手段を提供します。色素濃度の最適化により、オフターゲット結合(すなわち、ミトコンドリアDNAへの結合、点状細胞質蛍光)¹⁰が防止されます。最適化プロセスは、固定細胞用のDAPIを含む市販の封入剤(例:VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI)および生細胞用の公表された濃度の染色剤(例:Hoechst)^6,11,12を使用することで合理化できます。染色後、生細胞または固定細胞の核を適切な励起フィルター(紫外線[DAPIおよびHoechst]または遠赤[DRAQ5]など)を使用して視覚化します。DAPI、Hoechst、およびDRAQ5の励起最大値は、蛍光顕微鏡のスペクトルの両端にあります。この特性に加えて、これらの色素のDNA特異性および最適な濃度での使用により、オフターゲット蛍光が最小限に抑えられます。得られた画像は、黒い背景に対して明るい核を示しており、これらの核は単核細胞の細胞数の尺度として定量化されます。組織学的染色や明視野顕微鏡¹³を使用した核定量化の正確な染色ベースの方法は他にもありますが、これらのアプローチを使用した自動化は可能ですが、より困難です。

手動による核の定量化は依然としてゴールドスタンダードですが、手間と時間がかかり、長時間の計数による人為的ミスの影響を受けやすくなります。自動細胞計数プログラムは存在しますが、すべてのユーザーに好まれるわけではなく、法外な費用がかかる場合があり、特定のアプリケーションに対するバリデーションは最小限で済む場合があります。Pythonは、近年、生物学者にとって貴重でアクセス可能なリソースになっています。Pythonコンピュータビジョンライブラリは、画像分析¹⁴に特に役立ちます。ここでは、Pythonコードを使用して開発された実行可能プログラムを使用して、蛍光色素で染色された核を定量化し、蛍光顕微鏡でイメージングするための手順を段階的に説明します。ここで説明するプログラムを使用するために、コーディングスキルは必要ありません。このワークフローは、蛍光DNA色素が適用された細胞または組織に特異的です。明視野画像での使用は意図されていません。セクション1では、蛍光顕微鏡を使用して収集した画像を、このワークフローと互換性のある方法でキャプチャおよび保存する方法について説明します。セクション2では、核定量化プログラムを実行可能プログラムとして実行し、出力を取得する手順について説明します。実行可能プログラムは、提供された.exeファイルから直接実行でき、高品質の画像で核を定量化するための変更は必要ありません。この実行可能ファイルには、Windows ベースの PC が必要です。セクション 3 では、プログラムを実行ファイルではなく Python スクリプトとして実行するための手順を提供し (Mac または Linux ベースのシステムでは必須、Windows ベースのシステムではオプション)、必要に応じてコードをチューニングできます。セクション 4 では、正規化に結果を使用する方法について説明します。これらのプロトコルの後には、当研究室からの検証データを含む代表的な結果が発表されます。

プロトコル

注:補足ファイルは次のリンクにあります https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. 蛍光顕微鏡による画像取得・保存

1. イメージングする細胞または組織サンプルを調製し、目的のDNA色素による染色を含めます。ここで使用した画像を得るために、C2C12筋芽細胞(CRL-1772、American Type Culture Collection)を、50 mM EtOH⁶の有無にかかわらず、標準培養条件(5%CO₂、37°C、加湿)で6ウェルプレートで48〜72時間増殖させ、前述の¹³と同様に氷冷メタノールで固定した。固定細胞は、DAPI含有封入剤¹⁵を用いてマウントし、暗所で乾燥させてからイメージングした。
2. 確立された標準操作手順に従って、蛍光顕微鏡とコンピューターのすべてのコンポーネントの電源を入れます。顕微鏡に関連付けられているソフトウェアを開きます。
3. 顕微鏡を視覚化するように設定しますamp接眼レンズを通してファイル。対物レンズを確認します。必要に応じて、ノーズピースを目的の目的に回します。ソフトウェアプログラムに、画像領域を正確に表示するための目的の対物レンズが選択されていることを確認します。ここでは、10倍の対物レンズを使用して画像を撮影しました。
4. 照明を消した状態で、サンプル(スライド、プレート、またはディッシュ)をステージに置きます。適切なフィルターでライブイメージングをオンにし、露光時間を事前に決められた時間または自動露光に設定します。ここでは、DAPIフィルターと61〜62ミリ秒の露光時間を使用しました。特にセル密度の高い画像の場合、露光時間の設定に関するガイダンスについては、トラブルシューティングの表を参照してください。
5. 接眼レンズを使用して、染色された核が見えるまでグロス調整ノブを使用してピントをゆっくりと調整し、次に微調整ノブを使用して、核が鮮明で鮮明に見えるまでピントをゆっくりと調整します。
   注: 適切なイメージの例を 図 1 に示します。
   1. バックグラウンドの染色が過度に見られる場合、または核が非常に暗く見える場合は、露光時間を手動で調整してください。1つの画像では、一部の核の信号強度に目に見える違いがある場合があります。ただし、丸い形状は、信号干渉を最小限に抑えて、すべての原子核から見える必要があります。
      注意: ダウンストリームアプリケーションで使用されるプログラムは、さまざまな強度に対して堅牢です。核定量プログラムの開発と検証に使用される生画像には、さまざまなシグナル強度の画像が含まれ、Open Science Frameworkリポジトリ(上記のリンクを参照)から入手できます。

図1:DAPI染色された核の画像例。 これらの画像は、(A)低、(B)中程度、または(C)高細胞密度の核を最小限の背景で示しています。画像C全体で核の信号強度が異なることに注意してください。これは定量化を妨げませんでした。スケールバー(C)は100μmを示します。スケールバーは、核の定量に使用される画像から省略する必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. 接眼レンズを通して核にピントが合ったら、検出モードをカメラに切り替えます。微調整ノブを使用してフォーカスを調整します。
7. 必要に応じて露出時間を調整します。後続のサンプルや画像で使用するための最終的な露光時間に注意してください。
   注:すべての画像で同じ露光時間を使用することが理想的ですが、蛍光強度はサンプル間で定量化または比較されないため、このアプリケーションでは露光時間の変動が許容されます。
8. ソフトウェアの適切な画像キャプチャボタンを使用して画像をキャプチャします。サンプルに複数の染色剤が塗布されている場合は、フィルターを切り替えて(例:FITC、TRITC、Cy5)、同じ領域をイメージングしてマージします。
9. シャッターを適用して、サンプルの光への露出を最小限に抑えます。スケールバーに書き込まず、画像をユニバーサルフィギュアファイル形式(.tif、.png、または.jpg)で専用のフォルダーに保存します。各イメージ ファイル名が適切に説明されていること、またはファイル名に使用されるコーディングに適切なリンクされたドキュメントがあることを確認します。
   注:これは、定量化プログラムの画像ディレクトリになります。マルチカラーイメージングを使用した場合は、原子核の画像のみを別の専用フォルダにコピーしてください。これは、イメージングセッションの終了時にも行うことができます。ほとんどのイメージングソフトウェアでデフォルトのエクスポート設定を使用してエクスポートされた画像は、高品質の画像がキャプチャされている場合、通常、このプログラムで使用するのに十分な解像度です。ただし、エクスポート後に画像を視覚的にチェックして、核の形態が明確であることを確認する必要があります。画像を.jpg形式で保存する場合は、画像が過度に圧縮されないように注意し、品質を維持する必要があります。
10. シャッターを開き、ライブイメージングに戻り、サンプルを横切って別の場所にスキャンしてイメージングします。必要に応じて、手順1.8〜1.9を繰り返します。10倍の倍率で撮影した6ウェルプレートに播種した細胞の画像の場合、ウェルごとに10〜15枚の画像を撮影します(サンプル領域全体の細胞密度の一貫性によって異なります)。
11. 1 つのサンプルのすべての画像を取得したら、次のいずれかのオプションを実行します。
    1. 次のサンプルに進み、手順1.4〜1.10を繰り返します。
    2. プロトコルを一時停止し、別の時間に戻ります。サンプルは光から保護されたままにしておく必要があります。このオプションは、生細胞で作業する場合はお勧めしません。
12. イメージングが完了したら、部屋の照明をオンにする前に、すべてのサンプルが光で保護されていることを確認してください。画像を含むフォルダがローカルに保存されている場合は、サムドライブ、クラウドストレージの場所、または定量化プログラムが実行されるコンピューターからアクセス可能なその他のネットワークドライブにファイルを転送します。専用のフォルダに保存します。
13. 確立された標準操作手順に従って、顕微鏡とコンピューターのすべての部品をシャットダウンします。
14. これでイメージングは完了です。セクション2で説明されているように自動定量化プログラムを使用してファイルを分析するか、またはセクション3で説明されているようにプログラムをPythonスクリプトとして実行して分析します。

2. 自動核定量プログラムを実行ファイルとして実行可能

注: この方法は、プログラムを実行ファイルとして実行し、Windows ベースの PC と互換性があり、Windows OS ユーザーに推奨される方法です。Mac OS またはその他の Windows 以外のユーザーは、プログラムを Python スクリプトとして実行する必要があります (セクション 3 を参照)。

1. Pythonがコンピューターにインストールされていることを確認します。必要に応じて、python.org/downloads から Python をインストールするか (推奨)、Anaconda または Miniconda を使用してインストールします。公開日現在、このプログラムはPythonバージョン3.10-3.12でテストされています。
2. ブラウザを開き、[https://github.com/rbudnar/nuclei_counter/releases]に移動します。count_nuclei.zip という名前のファイルの最新バージョンをダウンロードします。
3. [ダウンロード]フォルダから、 Zipファイル を右クリックし、[すべてのファイルをローカルコンピュータ上の目的の場所に抽出]します( 図2Aを参照)。このファイルの場所は開いたままにしておきます。このファイル・パスは、ステップ 2.5 で使用します ( 図 2B を参照)。
   注: Count_nuclei がアプリケーション ファイルとして表示されます。これが実行可能ファイルです。
4. 検索バーでCMDまたはコマンドプロンプトを検索して、コマンドプロンプトを開きます。cd コマンドを使用して、ディレクトリーを実行可能ファイルのファイル・パス ( 図 2C を参照) に変更し、 Enter キーを押します。コマンドラインの例: C:\Users\janedoe>cd [cd の後のスペース、次にファイルパスをコピーして貼り付ける]
5. 次のコマンド ラインで、次のように入力して Enter キーを押します。
   count_nuclei.exe - img_dir "path/to/images" - output_dir "path/to/output" - save_images - output_count_filename "results.csv"
   ここで、path/to/images は、分析する画像を含むフォルダへのファイルパスです (ステップ 1.14 を参照)。path/to/output は、.csvファイルを保存するフォルダへのファイルパスです (指定されていない場合は、デフォルトで現在の作業ディレクトリになります)。results.csv は、結果のカウントが保存されるファイル名です (指定しない場合、出力ファイル名はデフォルトで count_results.csv になります)。
   注: コマンドラインには引用符が必要です。ファイル・パスの前に引用符の後にスペースがないことを確認します ( 図 2C を参照)。
6. 次のコマンド ラインが表示されたら、処理は完了です。これで、等高線と結果スプレッドシートが、手順 2.5 で出力ディレクトリとして指定した場所 (つまり、path/to/output、 図 2C を参照) で使用できるようになりました。
7. 等高線を目視検査して、カウントの品質を確認します。結果は、セクション 4 で説明されているように、データの正規化に使用できるようになりました。
   注:等高線が核を見逃しているように見える場合(例:核が薄すぎる)、または核のグループが1つのアイテムに集まっている場合(例:露出オーバー、背景が多すぎる、アーティファクト)、ユーザーはトラブルシューティングテーブルを参照する必要があり、セクション4に進む前に、画像取得を最適化するためにセクション1に戻る必要がある場合があります。

図2:セクション2のワークフローの主要部分の例。 (A)Downloadsフォルダからファイルを抽出します。矢印で示されている正しいフォルダをクリックして、ステップ2.3で目的の宛先への抽出(B)を有効にします。(C) ステップ 2.4 と 2.5 のコマンドの例、およびステップ 2.6 の完了を示す次のコマンド ラインの例。手順 2.4 (C) のファイル パスは、手順 2.3 (B) の抽出場所と一致することに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. Pythonスクリプトとしての自動核定量プログラムの実行

1. Pythonがコンピューターにインストールされていることを確認します。必要に応じて、python.org/downloads から Python をインストールするか (推奨)、Anaconda または Miniconda を使用してインストールします。公開日現在、このプログラムはPythonバージョン3.10-3.12でテストされています。
2. ブラウザを開き、[https://github.com/rbudnar/nuclei_counter]に移動します。「Green Code 」ボタンをクリックし、「 Download ZIP 」をクリックしてコードリポジトリをダウンロードします( 図3Aを参照)。
3. Windows OSの場合は、次の手順を使用します。Mac OS ベースのマシンについては、手順 3.4 を参照してください。
   1. [ダウンロード]フォルダから、[ファイル]を右クリックして[すべて抽出]を選択し、ファイルをローカルコンピュータに抽出します(図3B-Cを参照)。
   2. 抽出したファイルの場所で、nuclei_counter-main という名前のフォルダーを開きます。これがコード リポジトリです。
      注:これは、このプログラムを初めて使用するときにのみダウンロードする必要があります。抽出したファイルをアクセス可能なネットワーク上の場所に移動し、その場所をメモするだけです。
   3. 検索バーでCMDまたはコマンドプロンプトを検索して、コマンドプロンプトを開きます。Python が Anaconda または Miniconda によってインストールされている場合は、標準のコマンド プロンプトの代わりに Anaconda プロンプトを開きます。これは、検索バーに「Anaconda Prompt」と入力することで見つけることができます。
   4. cd コマンドを使用して、ディレクトリーをコード・リポジトリーに変更し、 Enter キーを押します。以下のコード行を参照してください。この行では、大文字と小文字が区別されます。ファイルパスをコピーするときは、nuclei_counter-mainという名前のフォルダが開いていることを確認してください。pyproject または pyproject.toml という名前のファイルが表示されます ( 図 3D を参照)。コマンドラインの例: C:\Users\janedoe>cd [cd の後のスペース、次にファイルパスをコピーして貼り付ける]
   5. 次のコマンド・ラインで、スペースとピリオドを含めて次のように入力します ( 図 3D を参照)。
      pip install -e .
      注: 手順 3.3.5 と 3.3.6 は、このプログラムを任意のコンピューターで初めて実行するときにのみ完了する必要があります。これがすでに完了している場合は、手順 3.3.7 に進みます。インストール プロセスの初期化には、少し時間がかかる場合があります。
   6. Enter キーを押します。このコマンドを実行すると、このスクリプトを実行するために必要なライブラリがインストールされ、イベントコードの調整が必要なときにリポジトリを編集可能モードでインストールします (図 3D を参照)。
   7. 次のコマンド・ラインに次のように入力して、ディレクトリーをメイン・ソース・コード・ディレクトリーに変更します ( 図 3E を参照)。
      CD「nuclei_counter」
   8. 次のコマンド行で、次のように入力して Enter キーを押します ( 図 3E を参照)。
      python count_nuclei.py --img_dir "path/to/images" --output_dir "path/to/output" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      ここで、path/to/images は、分析する画像を含むフォルダーへのファイルパスです (ステップ 1.14)。path/to/output は、.csvファイルを保存するフォルダへのファイルパスです (指定されていない場合は、デフォルトで現在の作業ディレクトリになります)。results.csv は、結果のカウントが保存されるファイル名です (指定しない場合、出力ファイル名はデフォルトで count_results.csv になります)。
      注: コマンドラインには引用符が必要です。ファイルパスの前に引用符の後にスペースがないことを確認してください。Pythonスクリプトは、指定されたファイルパス内のファイルを読み取り、ディレクトリ内のすべての画像に対して核カウントプログラムを実行します( 図3Eを参照)。結果のカウントは、指定した場所の結果.csvファイルに保存されます。
   9. 次のコマンド行が表示されたら、処理は完了しています ( 図 3E を参照)。これで、等高線と結果スプレッドシートが、手順 3.3.8 で出力ディレクトリとして指定した場所 (つまり、path/to/output) で使用できるようになりました。

図 3: Windows OS を使用したセクション 3 のワークフローの主要部分の例。 コードにアクセスするには、[ コード ]というラベルの付いた緑色のボタンをクリックし、(A)Zipファイル(矢印で示されています)をダウンロードします。(B)Zipファイル(青色で表示)を右クリックし、(C)目的の宛先を設定して抽出します。(D)コマンドプロンプトを開いた後、手順3.3.4および3.3.5のコマンドの例。ステップ 3.3.5 のコマンドはすべて 1 行にあることに注意してください。次の行に「ファイルを取得しています」で始まるテキストは、Enterキー(ステップ3.3.6、つまりコマンドの実行)後に表示されます。(E) ステップ 3.3.7 と 3.3.8 のコマンドの例、ステップ 3.3.8 の実行後のプログレスバー、ステップ 3.3.9 の完了を示すコマンドラインの例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. Mac OS の場合は、次の手順を使用します。
   1. [ダウンロード]フォルダから[ ファイル ]メニューをクリックし、[ 開く] を選択してファイルをローカルコンピュータに抽出します( 図4Aを参照)。
   2. 抽出したファイルの場所で、nuclei_counter-main という名前のフォルダーを開きます。これがコード リポジトリです。
      注:これは、このプログラムを初めて使用するときにのみダウンロードする必要があります。抽出したファイルをアクセス可能なネットワーク上の場所に移動し、その場所をメモするだけです。
   3. スポットライトを開く コマンド+スペースバー を押してターミナルを開きます。次に、「ターミナル」を検索します。
   4. cd コマンドを使用して、ディレクトリーをコード・リポジトリーに変更し、 Enter キーを押します。以下のコード行を参照してください。この行では、大文字と小文字が区別されます。ファイルパスをテキストドキュメントに入力し、ターミナルにコピーします。ファイルパスがcdの直前のテキストで始まっていることを確認します(例: 図4Bの/Users/userid)。コマンドラインの例: /Users/janedoe›cd /Users/janedoe/Desktop/nuclei_counter-main
   5. 次のコマンド行では、ユーザー ID の後にドル記号が表示されます ( 図 4B を参照)。ドル記号の後にスペースがあることを確認し、コマンドの末尾にスペースとピリオドを含めて、次のように入力します。pip の直後に適切な Python バージョンをスペースなしで含めます (pip3 install -e )。
      注: 手順 3.4.5 と 3.4.6 は、このプログラムを任意のコンピューターで初めて実行するときにのみ完了する必要があります。これがすでに完了している場合は、手順 3.4.7 に進みます。インストール プロセスの初期化には、少し時間がかかる場合があります。
   6. Enter キーを押します。このコマンドを実行すると、このスクリプトを実行するために必要なライブラリがインストールされ、イベントコードの調整が必要なときにリポジトリを編集可能モードでインストールします。
   7. 次のコマンド・ラインで、ドル記号の後にスペースがあることを確認してから、次のように入力してディレクトリーをメイン・ソース・コード・ディレクトリーに変更します ( 図 4C を参照)。
      CD「nuclei_counter」
   8. 次のコマンド ラインで、以下のコマンド ラインを入力します。Python の後の番号を、3 以外のバージョンを使用している場合は正しいバージョン番号に置き換えてください。次に、 Enter キーを押します ( 図 4C を参照)。
      python3 count_nuclei.py --img_dir "path/to/images" --output_dir " path/to/output" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      ここで、path/to/images は、分析する画像を含むフォルダへのファイルパスです (ステップ 1.14)。path/to/output は、.csvファイルを保存するフォルダへのファイルパスです (指定されていない場合は、デフォルトで現在の作業ディレクトリになります)。results.csv は、結果のカウントが保存されるファイル名です (指定しない場合、出力ファイル名はデフォルトで count_results.csv になります)。
      注: コマンドラインには引用符が必要です。ファイルパスの前に引用符の後にスペースがないことを確認してください。Pythonスクリプトは、指定されたファイルパス内のファイルを読み取り、ディレクトリ内のすべての画像に対して核カウンティングプログラムを実行します( 図4Cを参照)。結果のカウントは、指定した場所の結果.csvファイルに保存されます。
   9. 次のコマンド行が表示されたら、処理は完了しています ( 図 4C を参照)。これで、等高線と結果スプレッドシートが、手順 3.4.8 で出力ディレクトリとして指定した場所 (つまり、path/to/output) で使用できるようになりました。
5. 等高線を目視検査して、カウントの品質を確認します。結果は、セクション 4 で説明されているように、データの正規化に使用できるようになりました。
   注:等高線が核を見逃しているように見える場合(例:核が薄すぎるように見える)、または核のグループが1つのアイテムにクラスター化されている場合(例:露出オーバーの画像、背景が多すぎる、アーティファクト)、ユーザーは 表1 を参照する必要があり、セクション4に進む前に、画像取得を最適化するためにセクション1に戻る必要がある場合があります。

図 4: Mac OS を使用したセクション 3 のワークフローの主要部分の例。 コードをダウンロードした後( 図3Aを参照)、(A) Zip をクリックして抽出します file (青で表示)そして目的の目的地を設定します。(B)ターミナルを開いた後、手順3.4.4(ディレクトリをコードリポジトリに変更)および3.4.5(pipのインストール)のコマンドの例。(C) ステップ 3.4.7 と 3.4.8 のコマンド、ステップ 3.4.8 の実行後のプログレスバー、ステップ 3.4.9 の完了を示すコマンドラインの例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 実験データを正規化するためのカウントの使用

1. 自動プログラムを使用して決定された核定量化で各画像をリンクするresults.csvファイルを開きます。
2. 正規化の方法を決定します:1)画像ごとに(例:マルチカラー蛍光顕微鏡の場合)、2)サンプルあたりの平均核数と参照サンプル(または条件)の比率としてデータを正規化し、3)サンプルあたりの核数に正規化します(例:サンプル面積に全核数を外挿します)。正規化の方法に関する推奨事項は、「ディスカッション」セクションにあります。
   1. 正規化を画像ごとに行う場合は、各画像の実験データをその画像の核数で割るだけです。
   2. データを比率として正規化するには、以下で説明する手順に従います。
      1. 1回の複製で複数の画像が収集されたサンプル(例:6ウェルプレートの1つのウェルから10〜15枚の画像を取得)については、画像あたりの平均核数を計算します。これらの核数は、単核細胞または多核細胞(筋管など)で融合した多数の細胞を想定した細胞数と見なされます。
      2. 参照サンプルまたは参照条件(例:コントロール条件のすべてのサンプルの平均カウント)を選択し、カウントをメモします。
      3. すべてのサンプルのカウントをその参照カウントで除算し、正規化値を求めます。参照サンプルを使用した場合は、参照サンプルの正規化値を 1 として使用します。
         注: 参照条件を使用した場合、条件全体の平均正規化値は 1 になります。参照よりも核数が少ない(つまり、密度が低い)サンプルは、正規化値が1未満になり、参照よりも核が多い(つまり、密度が高い)サンプルは、正規化値が1より大きくなります。
      4. 各ウェルの実験データを、対応する計算された正規化値で除算します。
   3. サンプルあたりの核数にデータを正規化するには、以下で説明する手順に従います。
      1. 1回の複製で複数の画像が収集されたサンプル(例:6ウェルプレートの1つのウェルから10〜15枚の画像を取得)については、画像あたりの平均核数を計算します。これらの核数は、単核細胞、または多核細胞(筋管など)で融合した細胞の数を想定した細胞数と見なされます。
      2. データの派生元であるスライド(カバースリップ)、ウェル、またはディッシュの表面積を特定します。この情報は、製品 Web サイトの仕様セクションに記載されています。
      3. キャプチャされた各画像の領域を決定します。この情報は、多くの場合、イメージングソフトウェアまたは解析ソフトウェアでメタデータとして利用できます。
      4. サンプルの表面積と画像領域が同じ単位(mm²など)で表されていることを確認してください。そうでない場合は、目的の単位に変換します。
      5. 次の式を使用して、各サンプルの合計カウントを計算します。
         TC = AC • (SA/IA)
         ここで、TC は総カウント、AC は平均カウント、SA は表面積、IA は画像領域です。
      6. 実験データをサンプルの対応するTCで除算します。
3. 実験データを正規化し、必要に応じて統計解析に利用します。

結果

各バッチ画像実行では、1)同定された核の輪郭を示す輪郭が適用された画像ファイルのセット(図5)、および2)画像ファイル名と関連するカウントをリンクする.csvファイル(スプレッドシート)が生成されます。等高線を表示すると、ユーザーはカウント品質を視覚的に評価できます。具体的には、セクション 1 に従って取得された画像には、すべての (またはほぼすべて) の核が、プログラムによって原子核がカウントされたことを示す緑色の実線で囲まれている必要があります。これらの等高線は、ここでプログラムを調整するために使用されました。

図5:元の画像と対応する輪郭の例。 (A-C)解析前のオリジナル画像と、そのすぐ下にある解析後の(D-F)対応する等高線の例。スケールバー(C)は100μmを示します。スケールバーは、核の定量に使用される画像から省略する必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

初期結果を使用した検証
さまざまな細胞密度のC2C12筋芽細胞をメタノール固定し、封入剤中でDAPIで対比染色し、.jpgファイル形式で10倍の倍率で120枚の画像を取得しました。自動プログラムは、これらの画像を含むフォルダーに設定されたイメージ ディレクトリで実行され、結果の .csv ファイルが保存されました。これとは別に、各画像は、自動化されたカウントと互いのカウントを知らなかった2人の訓練を受けた研究者によって手動で定量化されました。生の画像、自動プログラムによって生成された輪郭、および手動および自動カウントを含む結果スプレッドシートは、Open Science Framework(OSF)リポジトリで入手できます(セクション1のリンクを参照)。クラス内相関係数(ICC;平均測定)は、SPSS Statisticsを使用して計算され、1)2つの手動カウントと2)2つの手動カウントの平均と自動プログラムを使用して得られたカウントとの間の評価者間の信頼性を決定しました。同様のアプローチは、蛍光顕微鏡16,17,18を用いて得られた画像中の物体を定量化するように設計された他のプログラムを検証するために使用されてきた。また、ICCは、各四分位数の平均手動カウントと自動カウントの間で計算され、データセット全体の評価が細胞密度に基づく信頼性の潜在的な変化を隠さないようにしました。四分位数は、平均手動カウントに基づいて 25^{パーセンタイル}、50^パーセンタイル、および 75 パーセンタイル カット ポイントを使用して定義され、四分位数 1 (Q1; 最も低いセル密度) から Q4 (最も高いセル密度) までの範囲です。ICCは平均的な測定値に基づいて報告され、次の定義に基づいて解釈されます:悪い(ICC <0.50)、中程度(0.50≤ICC <0.75)、良い(0.75≤ICC <0.90)、または優れている(ICC ≥0.90)¹⁹。

画像あたりの核は、手動カウント平均に基づいて44.5から1160の範囲でした。評価者間の信頼性は、2つの手動カウント間で優れていました(ICC>0.999、p<0.0001;図6A)平均手動カウントと自動カウントの間 (ICC = 0.993, p < 0.0001;図6B)。信頼性は、四分位数全体で優れたままでした(Q1:ICC= 0.996、p < 0.0001;Q2: ICC= 0.997, p < 0.0001;Q3: ICC = 0.998, p < 0.0001;Q4:ICC= 0.986、p<0.0001;図6C-F)。図 6B の最適線から遠い 1 つのデータ ポイントは、図 7 に示すイメージを表しています。画像には、複数の原子核がグループ化されたいくつかの領域があり、コンピュータービジョンプログラムが各原子核を認識するのを妨げています。この問題は、露光時間を短くすることで解決できます。表 1 は、このようなイメージの処理方法を示しています。

図6:評価者間の信頼性。データセット全体にわたる評価者間の信頼性 (A) 手動評価者カウント間、および (B) 自動カウントと平均手動カウント間。(C-F)自動カウントと四分位数ごとの平均手動カウント間の評価者間信頼性。信頼性は、クラス内相関係数 (ICC) で表されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:正確な核定量に2つの障壁がある画像の例。 (A)元の画像と(B)関連する輪郭。矢印1は、複数の原子核が凝集し、丸い核の形状が歪んで複数の原子核のソフトウェア検出が妨げられている領域を示しています。これは、この画像全体のいくつかの場所で発生します。矢印2は、複数の原子核の背後に現れる色あせたハローを示しています。このハローは、ソフトウェアがそれを核として含めるのに十分な明るさに見えたため、周囲の複数の原子核のカウントが失われました。この画像は、 図 6B の最適線から遠く離れた 1 つのデータ ポイントを表しており、これらの障壁の潜在的な問題を強調しています。スケールバー(A)は100μmを示します。スケールバーは、核の定量に使用される画像から省略する必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

当社の核定量化プログラムには、既存のオプションに比べていくつかの利点があります。最小限の技術スキルしか必要とせず、核定量という特定のタスクに対して検証され、オープンソースであること。後者は、コスト関連の障壁を克服します。最終的に、このプログラムは、細胞生物学者や分子生物学者に、蛍光顕微鏡を使用して撮影された画像中の核を迅速かつ正確に定量するための追加オプションを提供します。現在利用可能な自動核または細胞カウントプログラムは、すべてのユーザーに好まれているわけではなく、中には法外な費用がかかるものもあり、特定のアプリケーションでは検証が最小限であるか、または存在しない可能性があります。BioTek Cytationラインなどの専用機器には、核染色²⁰を使用したin situ細胞カウントの検証を行う技術情報のほか、さまざまな追加アプリケーションが付属しています。バリデーションデータが存在し、Cytation製品ラインは広く使用されていますが、特にSeahorse Extracellular Flux Analyzersとインターフェースして生細胞データを簡単かつ効率的に正規化する場合、この製品は利用可能な機器の資金が限られているラボにとっては法外なコストになる可能性があります。例えば、蛍光顕微鏡用の4つの対物レンズと4つのフィルターキューブを搭載したベースモデルの定価は、2024年に10万ドルを超えました。専用の機器を購入する手段がない人のために、オープンソースソフトウェアは画像分析のための無料の代替手段を提供します。核や細胞の定量化に役立つオープンソースソフトウェアとしては、ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; ^{available at 21}.ImageJプラットフォームを使用して画像処理自動化のためのマクロスクリプトを記述したい人のために、プラグインが利用可能になりました。全細胞画像を用いた位相コントラストまたは明視野顕微鏡を用いたImageJベースの細胞計数自動化は、以前に説明されています^22,23。CellProfilerは、蛍光色素または標準的な組織学的染色で染色された細胞画像の解析のための広く公開されているアプリケーションであり、さまざまな生物学的アプリケーションにわたるその有用性を説明する初期の論文は、バリデーション²⁴としてよく引用されます。しかし、この原稿は特定の生物学的所見を検証するものではなく、原子核計数²⁵など、使用されるさまざまな自動化パイプラインについて追加の検証と透明性が必要です。さらに、CellProfilerは細胞解析のための効率的なソフトウェアパッケージですが、すべての科学者がユーザーフレンドリーだと感じているわけではありません。そこで、オープンソースソフトウェアを使用して原子核を定量化するための代替自動化プログラムを開発し、検証することを目指しました。具体的には、Pythonの既存のコンピュータービジョンライブラリを使用して、このワークフローを開発しました。

この方法は、エンドユーザーが^DAPI26などのDNA染色を使用して染色した細胞または組織から始まります。自動化ソフトウェアと互換性のある方法で画像をキャプチャおよび保存するための一般的なガイドラインが提供されています。顕微鏡やイメージングソフトウェアによって詳細は異なる場合がありますが、セクション1の一般的なワークフローは同じで、定量化可能な画像を取得できます。生サンプルを使用する場合は、適切な個人用保護具を着用し、それらのサンプルに適したイメージング環境(温度、CO₂の割合、バッファーの追加など)を確保するように注意する必要があります。²⁷.このプロトコルはDNA色素のみのイメージングを説明していますが、ユーザーはマージ目的で同じ領域の他の色をキャプチャし¹⁵、核画像を単に別のフォルダにコピーして定量化プログラムで使用することができる。イメージングは、生サンプル用の適切なPPEを使用して暗室で実施し、必要に応じて適切な消毒を使用する必要があります(例:70%エタノールを使用)。染色されたサンプルは、ライトをオンにする前に光から保護する必要があります。核の正確な定量には、高品質の画像キャプチャが重要です。適切な露光時間を持ち、明るい核と黒い背景との間に強いコントラストを持つ画像であっても、過度に凝集した細胞や細胞群の後ろにハローが存在すると( 図7を参照)、定量精度が低下する可能性があります。このような場合、信号の強度を下げるために露光時間を変更する必要があるかもしれません。これにより、核信号のマージを最小限に抑え、ハローを最小限に抑えながら、丸い形の核を検出するのに十分な強度の信号を維持する必要があります。これらの手順が不十分な場合は、サンプルの隣接部分をイメージングする必要があるかもしれません。1つの実験のすべての画像を同じ倍率で撮影し、使用する対物レンズに対応する倍率をイメージングソフトウェアで適切に設定する必要があります。特に、イメージングに使用する対物レンズがイメージングソフトウェアの設定と一致することは、イメージングされた領域からウェル(またはスライド)領域全体に外挿される場合に重要です。このステップは、対物レンズが切り替わるたびに行う必要がありますが、顕微鏡やソフトウェアのセットアップ時に見落とされがちです。セクション1に必要な時間は、いくつかの要因(蛍光顕微鏡のユーザーエクスペリエンス、画像とサンプルの数、顕微鏡など)によって異なります。2つの6ウェルプレートでウェルあたり10〜15枚の染色された核の画像を撮影するには、ユーザーは約1〜2時間の時間を確保する必要があります。

画像をキャプチャして専用のフォルダに保存したら、定量化する準備が整います。定量化の最も簡単な方法は、Pythonやライブラリをインストールせずに、このパッケージ化された自動化プログラムを実行することです(セクション2)。プログラムは実行可能ファイルとして準備され、Pyinstallerを使用してパッケージ化されたことに注意してください。Pyinstaller を使用してビルドされたソフトウェアは、通常、ウイルス対策ソフトウェアによってフラグが付けられます。ウイルス対策ソフトウェアがファイルを開くのをブロックした場合、ユーザーはファイルに安全であるとフラグを立てて続行する必要があります。これは、セクション 2 を正常に実行するために重要です。あるいは、必要に応じて、任意のユーザーが自動定量化プログラムを実行可能ファイルではなくPythonスクリプト(セクション3)として実行することを選択できます。ユーザーがMacまたはLinuxオペレーティングシステムを使用してプログラムを実行する場合、プログラムはPythonを介して実行する必要があります。この方法は Pyinstaller を必要としませんが、技術的にはより困難かもしれません。セクション 3 で詳しく説明されている段階的なプロトコルと例は、このプログラムをスクリプトとして実行する際の技術的な障壁を取り除くことを目的としています。セクション 2 とセクション 3 のどちらを使用しても、コマンド プロンプトにコードが正しく入力されていることを確認することが重要です。プロトコル全体にコードの例行が含まれており、ユーザーはスペース、引用符、その他の句読点に細心の注意を払う必要があります。また、ユーザーは、ファイルパスが正確であることを確認する必要があります。画像と出力のファイルパスをWord文書で利用できるようにしておくと便利です。このWord文書にコマンドを入力して、必要に応じてコピー/貼り付けることもできます。

セクション4で説明したように、この自動核定量プログラムから得られたカウントを使用して実験データを正規化するための複数のアプローチがあります。実験データが各画像内の多数のイベントを含み、その割合(例えば、アネキシンV陽性細胞²⁸の割合、ACE2受容体を発現する細胞の割合²⁹、染色粒子を取り込みする細胞の数³⁰など)が所望される画像ベースの実験の場合、各画像の実験データは、単純に結果の数で割ることができる(0から1の割合になる)。次に、同じスライド、ディッシュ、またはウェルからの複製画像全体で平均比率を計算できます。パーセンテージが必要な場合は、最終的な比率に100を掛けるだけです。最後に、これらの平均比率またはパーセンテージは、ダウンストリームの統計分析で使用できます。正規化されるべき実験データが、生細胞における機能実験(例えば、酸素消費率^6,11,12)または細胞培養上清(例えば、上清^中の乳酸デヒドロゲナーゼ活性または特定の分泌サイトカイン³²の濃度など)からのものである場合、核数は、まず、同じウェルから捕捉されたすべての画像にわたって平均化されるべきである。次に、核数をスライド(カバースリップ)、ウェル、またはディッシュの表面積に外挿するか、またはカウントを参照サンプルまたは条件に対する比率として表すことができます。スライド、ウェル、またはディッシュの表面積への外挿は、データが得られた細胞の数(単核細胞を使用している場合)に対して実験データを表現するのに有用です(例:10³細胞あたり1分あたりに消費される酸素)。この方法を使用するには、スライド(カバースリップ)、ウェル、またはディッシュの表面積と、各画像に写っている面積がわかっている必要があります。サンプルが利用可能な表面積全体をカバーしていない、実験データが少量の上清からのものである(つまり、単位体積あたりの活性または濃度として表される)、または画像および/または表面積が不明な場合、最良の選択肢は、単一のサンプルのすべての画像にわたる核数を平均化し、参照サンプルまたは条件に対する核数を表すことです。結果の値は、核密度または細胞密度(単核細胞を使用している場合)の実験データを補正するために使用されます。

この方法は簡単に実行できますが、どのユーザーが認識する必要があるかについていくつかの潜在的な問題があります。これらの潜在的な問題と、考えられる原因、および問題を解決するためのトラブルシューティング手順を 表 1 に示します。ここで説明するプログラムには、既存のソフトウェアと比較して重要な利点があります。ただし、いくつかの制限を認識する必要があります。主な欠点は、定量化プログラムは蛍光顕微鏡を使用して取得した画像でのみ使用でき、明視野画像では使用できないことです。プログラムの構築には10倍の倍率で撮影されたDAPI染色画像を使用しましたが、プログラムは色やサイズではなく核の形態を認識するように構築されているため、他のDNA色素や倍率と併用することができます。さまざまな細胞密度を含む画像でプログラムの精度を検証しましたが、エンドユーザーは細胞密度が範囲外である可能性があります。この場合でも、高品質の画像が取得されていれば、正確なカウントが予想されます。ただし、ユーザーは精度を確保するために、輪郭と出力を慎重にチェックする必要があります。細胞培養アプリケーションでは、画像中の核の定量は単分子膜の細胞に最も適しています。培養細胞が重なると、核がマスキングされ、核量が過小評価される可能性があります。画像内の核を定量化するという2次元の性質により、懸濁液中の細胞、厚い組織ブロック、またはその他の3次元アプリケーションから核の総数を決定するためにこのプログラムを使用することはできません。しかし、このプログラムでは、厚い組織ブロックなどの3次元モデルから撮影された2次元画像で、蛍光DNA色素で標識された核を定量することができます。目的のアプリケーションのために画像中の核を定量化する有用性は、エンドユーザーが決定する必要があります。

問題	考えられる原因	考えられる解決策
画像の背景が過剰	露光時間が長すぎる	露光時間を短縮
画像内では原子核が互いに合体しているように見えます	蛍光DNA色素濃度が高すぎる、またはDNA色素封入剤が多すぎる	最適化中に色素濃度を下げます。封入メディアの使用は可能な限り少なくしてください
原子核が明るすぎる、または一部の原子核が見えない	露光時間が短すぎる	露光時間の増加
	光退色	染色されたサンプルを暗闇に保管し、サンプルの照明への曝露を最小限に抑えることで、光退色を防ぎます(たとえば、必要最小限の露光時間を使用し、画像がキャプチャされた後やメモを取っている間など、必要のないときは照明をオフにします)
ハロー効果または非核固有形状が表示される	露光時間が長すぎる	露光時間を短縮
	デリケートなタスクワイパーやベンチトッププロテクターによる生細胞内の糸くず、または固定細胞に付着した糸くず	糸くずの出ない環境を確保する:サンプルが曝露されるとき(生細胞のバイオセーフティキャビネット内、固定細胞の固定および乾燥中、または染色プロセス中など)の繊細なタスクワイパーの使用を最小限に抑えます。ベンチトッププロテクターが染色中にスライドやプレートに糸くずを残さないようにしてください
	その他、固定細胞・組織表面の異常	サンプルの取り扱いには細心の注意を払い、固定および染色の際には適切な予防措置とベストプラクティスに従ってください
	光路の乱れ	顕微鏡のすべての部品が清潔で、糸くずやほこりがないことを確認してください。イメージングの前に、70%エタノールでスライド/プレート/皿の外側を清掃し、環境のほこりや糸くずを取り除きます
実行可能ファイルが開かない	ウイルス対策ソフトウェアがファイルをブロックしました	ファイルに安全としてフラグを立てる
コマンド プロンプトのエラー	コマンドラインのスペースに関する問題	コマンドの先頭がコマンド ラインの ">" 記号の直後にスペースなしで入力されていること、ファイル パスの左引用符の後にスペースがないこと、およびスペースと指定されたコードと例と一致していることを再確認してください。
	コマンドラインで使用される不適切なケース	コードでは大文字と小文字が区別されます。必要に応じて、大文字と小文字を必ず使用してください
	ファイルパスの問題	ファイルパスが、関連付けられたファイルフォルダの内部を示していることを確認します(つまり、ファイルパスがコピーされたときにファイルフォルダが開いていることを確認してください)。
上記のトラブルシューティング手順を使用して解決できないプログラムの問題	上記のソフトウェアまたはコマンドラインの問題。	GitHub から問題を送信します。[https://github.com/rbudnar/nuclei_counter] に移動します。上部のメニューバーで、[問題]([コード]の右側にある2番目のオプション)を選択します。右側にある「新しい問題」と表示されている緑色のボタンをクリックして送信します。問題を送信する前に、GitHub にログインするように求められます。必要に応じて無料のアカウントを作成するオプションもあります。

表1: 高品質の画像をキャプチャし、自動核定量ワークフローを実行するためのトラブルシューティング。

全体として、本明細書に記載されている方法は、コンピュータビジョンライブラリを使用して開発し、複数の評価者からの手動カウントに対して検証された自動核定量プログラムを使用するための段階的な詳細を提供します。このプログラムは、さまざまなレベルのコーディング関連の技術スキルを持つ科学者が使用できるように開発され、無料で利用でき、特に核定量化のタスクのために検証されました。手動カウントと比較して、このプログラムはエンドユーザーの貴重な時間を節約し、データの正規化のための正確で信頼性の高い核カウントを提供します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer with access to results file from method 2 or 3	-	-	See step 2.6 (for Method 2) or step 3.3.9 or 3.4.9 (for Method 3)
Computer with internet access, modern browser	-	-	e.g., Google Chrome
Computer with internet access, modern browser, and Windows OS	Varies	Varies	For Mac, Linux, or other OS, use Method 3
Computer with software for image capture	Zeiss	AxioVision	Other software is acceptable; must be compatible with the fluorescence microscope
File location for output (results spreadsheet and image contours)	-	-	Can be a new, empty folder
Fluorescence microscope	Zeiss	Axiovert 200M	Other fluorescence microscopes are acceptable; must be equipped with appropriate filter cubes, desired objective, and camera
Folder containing all images to be quantified	-	-	See step 1.12
Python version 3.10 or higher	Python	-	Available for free download and installation at https://www.python.org/downloads/
Samples to be imaged	-	-	Fixed or live, stained or counterstained with fluorescent DNA dyes
Spreadsheet software	Microsoft	Excel	Similar spreadsheet software is also acceptable