JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

本研究は、MT-TGFαマウスが胃内で鎮痙性ポリペプチド発現化生(SPEM)を示すことを示しています。プロモーターのリーキー性は、主要な細胞系統がSPEMにまで遡るという実証を妨げました。そこで、ドキシサイクリン誘導性マウスモデル(Doxi-TGFα)を追加開発し、SPEMが主細胞に由来することを確認しました。

要約

メネトリエ病(MD)は、巨大な皺状襞、酸分泌の減少、およびタンパク質の喪失を特徴とするまれな後天性前癌性胃疾患です。MD患者は、胃の中でEGF受容体(EGFR)リガンドの発現が増加し、成長因子α(TGFα)を形質転換します。EGFR中和抗体であるセツキシマブは、迅速な臨床的改善と組織学的寛解をもたらします。これらの知見以外に、病因と根底にある分子メカニズムはよく理解されていません。メタロチオネイン(MT)-TGFαトランスジェニックマウス系統は、中心窩過形成や頭頂細胞の喪失など、MDの組織病理学的特徴を再現した最初のMDマウスモデルです。このマウスモデルでは、TGFαは重金属誘導性MTエンハンサー/プロモーターによって駆動されます。以前の研究では、TGFαを誘導するために、飲料水または硫酸カドミウム(CdSO4)の腹腔内注射に硫酸亜鉛(ZnSO4)が使用されていました。しかし、MT-TGFαマウスは重金属処理を行わずに表現型を発現し、プロモーターの漏れを示すことがわかりました。また、TGFαの過剰発現がチーフ細胞の分化に重要な転写因子であるMist1の発現を抑制し、Mist1-CreERT2マウス系統を用いたチーフ細胞の遺伝子操作を阻害することを見出しました。これを克服するために、ドキシサイクリン治療(CMV-rtTA;TetO-TGFα)。Doxi-TGFαマウスモデルは、MT-TGFαモデルよりも軽度の表現型を発達させますが、中心窩過形成や頭頂細胞の喪失など、MDの特徴を再現しました。Doxi-TGFαマウスモデルを用いて、Mist1-CreERT2マウス系統を用いた系統追跡により、MDでは痙痙性ポリペプチド発現化生(SPEM)が誘導され、主細胞からSPEMが誘導されることを見出しました。MT-TGFαおよびDoxi-TGFαマウスモデルはどちらもMDの in vivo モデルを提供し、MDの病因の根底にある分子メカニズムと疾患の治療選択肢を調査するのに役立ちます。Doxi-TGFαマウスは、他の組織におけるTGFαの過剰発現の影響を研究するための有用なモデルにもなります。

概要

メネトリエ病(MD)は、タンパク質喪失性肥大型胃症とも呼ばれ、まれな胃前がん疾患です。MD患者の胃は、胃粘液分泌の増加につながる大規模な中心窩過形成を示し、胃酸分泌の減少につながる壁細胞の数の減少につながります。さらに、タンパク質は胃粘膜全体で選択的に失われ、低アルブミン血症と末梢浮腫を引き起こします1,2,3。MDの病因は、メタロチオネイン(MT)遺伝子エンハンサー/プロモーターの制御下でTGFαを過剰発現したトランスジェニックマウスが、胃でMDの表現型を再現したことが報告されるまで知られていませんでした4,5。MD患者の胃も、EGF受容体(EGFR)リガンドであるTGFαの発現増加を示しました。抗EGFR抗体であるセツキシマブは、MDに対する最初の有効な治療法であると報告され、TGFαの過剰発現によるEGFRの活性化がMDの病因に寄与することが確認されました6,7。

その後、MDのマウスモデルとしてMT-TGFαマウスラインが採用されています。TGFαの発現は重金属応答遺伝子によって制御されているため、TGFαの発現を誘導するために、メタロチオネインエンハンサー/プロモーター、飲料水中の硫酸亜鉛(ZnSO4)、または硫酸カドミウム(CdSO4)の腹腔内注射が使用されています5,8。MT-TGFαマウスモデルは、MDの表現型についてさらに特徴付けられています。このマウスモデルを用いて、TGFαはムチン分泌表面中心窩細胞の分化を誘導し、酸分泌性頭頂細胞とペプシノーゲン分泌主細胞系統への分化を阻害することが示されている9,10。また、胃体/眼底粘膜が洞状化し、胃腺の基部にトレフォイル因子2(TFF2)陽性細胞が存在することも示されており、MD8,11では鎮痙性ポリペプチド発現化生(SPEM)が起こることが示唆されています。

本研究では、MT-TGFαマウスが重金属処理なしでMDの特徴を発現することを示しています。これらの表現型には、主要な細胞分化に不可欠であり、SPEMで失われる転写因子であるMist1の発現の喪失が含まれます。Mist1が失われたため、Mist1-CreERT212 マウス系統をMT-TGFαマウス系統とともに利用して、系統追跡によりMD中のSPEMがチーフ細胞から生じるかどうかを調べることができませんでした。MT-TGFαマウスモデルの漏れを克服することを目的に、新しいMDマウスモデル(CMV-rtTA13;TetO-TGFα14) ここで、TGFα はドキシサイクリン治療 (Doxi-TGFα) によって誘導されます。このマウスモデルもMDの特徴を表示していることを確認しました。Doxi-TGFαマウスモデルを用いて、Mist1-CreERT2マウス系統を用いた系統追跡により、SPEMがチーフ細胞から生じることを示しました。本研究では、2つのMDマウスモデルを紹介します。どちらのモデルも、病因の調査や潜在的な治療標的の検索に使用できます。新しいDoxi-TGFαマウスは、MD表現型の開始を正確に制御する必要がある場合や、Mist1-CreERT2マウス系統を使用して主細胞の遺伝子改変が必要な場合に特に価値があります。

プロトコル

すべての畜産と手順は、イェール大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認され、研究、教育、および試験で使用される動物の利用と世話に関する米国政府の原則に従って承認されました。

1. マウス実験

  1. マウスの治療
    1. MT-TGFαマウス(生後2〜4ヶ月の雄と雌の両方)を25mM ZnSO4の飲料水で2週間治療し、TGFαの過剰発現を誘導します。
    2. CMV-rtTA/+を治療します。TetO-TGFα/+ (Doxi-TGFα) マウス (生後 2 か月の雄と雌の両方) を飲料水に 2 mg/mL のドキシサイクリンを 2 週間投与して TGFα の過剰発現を誘発します。
    3. Mist1-CreERT2/+を1つ追加します。R26-LSL-mTmG/+雄または雌マウスを使用し、MDマウスモデルの主細胞の系統追跡のために、繁殖ケージに異性のDoxi-TGFαマウスを1匹追加します。
    4. Mist1-CreERT2/+を注入します。R26-LSL-mTmG/+;CMV-RTTA/+;TetO-TGFα/+ マウス (生後 2 か月の雄と雌の両方) とタモキシフェン (37.5 mg/kg) を腹腔内投与。腹部の右と左下の象限を交互に行い、内臓に当たらないように、7日間連続して注射します。ドキシサイクリン処理(2 mg / mL)により、飲料水で2週間TGFα発現を誘導します。.
      注:タモキシフェン治療の有無にかかわらず野生型マウスで頭頂細胞を数えることにより、ここで行われるように、胃15,16にタモキシフェン誘発性の損傷がないことを確認します(補足図1)。
  2. 胃組織の固定
    1. TGFα過剰発現の2週間後にイソフルランの過剰摂取によりマウスを安楽死させます。.化学フュームフードにデシケータージャーを装着し、液体麻酔薬との直接接触を防ぐ穴あきプラットフォームにマウスを置きます。蓋を閉め、マウスが60秒以上呼吸を欠くまでマウスを監視し、その後子宮頸部脱臼が続きます。
    2. 胃食道接合部を切断し、胃に5mmの十二指腸を取り付けて十二指腸を切断し、はさみと鉗子を使用して胃の周りのすべての腹膜靭帯を切除することにより、胃を解剖します(図1A)。
    3. 十二指腸側にピペットチップが取り付けられた10mLシリンジを使用して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を点滴します。指で絞って管腔の内容物を取り除きます。3 回繰り返します (図 1B)。
    4. ピペットチップを取り付けた別の10mLシリンジを使用して、2mLの10%ホルマリンで胃を膨らませます。.胃から先端を取り外しながら、胃十二指腸接合部で鉗子で5〜10秒間しっかりとクランプします(図1C)。
    5. 膨らませた胃を10%ホルマリンに10%ホルマリンで4°Cで一晩沈め、振とうします(図1D)。
      注意: ホルマリンなどの有毒物質を扱う場合は、適切な保護具を使用してください。
  3. パラフィン包埋のための胃の準備
    1. カミソリの刃を使用して十二指腸と前胃を切り取ります(図1E)。胃組織をPBSで5分間、振とうしながら3回すすぎます。
    2. かみそりの刃を使用して、胃を同じ厚さ(3〜5 mm)の3〜4個のリングに切ります。胃リングを2%アガロースに埋め込んで、向きを維持します。曲率の小さい側を同じ方向に配置して、胃リングを近位から遠位のリングに順番に配置します(図1F)。
    3. アガロースに包埋した胃リングを組織カセット(図1G)に入れ、サンプルをパラフィン包埋のための組織学コア施設に提出します17。

2. 免疫蛍光染色

  1. スライドの準備
    1. ドライオーブンまたは60°Cに設定されたヒートブロックで、パラフィン切片を載せたヒートスライドを最低1時間から一晩放置します。室温まで冷まし、スライドラックに入れます。
  2. 脱パラフィン、再水和、抗原賦活化
    1. 2つのスライドジャーAとBにラベルを付け、それぞれに組織を完全に沈めるのに十分なTrilogy溶液を充填します。
    2. スライドラックをジャーAに置き、両方のジャーを圧力鍋に入れます。圧力鍋を高圧に15分間設定します。圧力鍋を冷ましてから、スライドを開いて取り出してください。
    3. すぐにスライドラックを瓶Aから瓶Bに2分間置き、パラフィンがスライドから除去されていることを確認します。ジャーBからスライドを取り出し、脱イオン(DI)水に入れます。
      注:Jar Aには、一度使用したトリロジーを充填できます。新しいトリロジーは常にJar Bで使用する必要があります。
    4. スライドをトリスバッファー生理食塩水(TBS)に5分間置いてから、ブロッキングに進みます。
  3. 非特異的バックグラウンド染色のブロッキング
    1. スライドラックからスライドを取り出し、横にたたいて余分なTBSを取り除きます。
    2. 疎水性マーカーを使用して、組織の周りにボックスを描きます。ブロッキングバッファーを塗布して組織を完全に覆い、室温の加湿チャンバー内で30〜60分間インキュベートします。
  4. 一次抗体によるインキュベーション
    1. 異なる宿主種で産生された標的タンパク質の一次抗体を選択し、メーカーの推奨に従って抗体希釈液で希釈してください。この研究では、H+/K+-ATPase、GIF、Mist118,19、CD44v920,21の抗体を使用しました。一次抗体の詳細については、材料表をご覧ください。
    2. ブロッキングバッファーを取り外し、希釈した抗体を塗布し、スライドを加湿チャンバーに戻します。4°Cで一晩インキュベートします。
    3. 一次抗体を取り出し、スライドをTBSで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。
  5. 二次抗体とレクチン
    1. 一次抗体の宿主種に応じて二次抗体を選びます。レクチンは二次抗体と混合して同時に適用することができます。
    2. 二次抗体とレクチンは、メーカーの推奨に従って抗体希釈液で希釈します。本研究で使用した二次抗体およびレクチンの詳細については、 材料表をご覧ください。
    3. 二次抗体、レクチン、DAPI(1 μg/mL)を塗布し、スライドを加湿チャンバーに戻します。光を避けて室温で1時間インキュベートします。
    4. 加湿チャンバーからスライドを取り出し、洗濯ごとにTBSで5分間3回すすぎます。
  6. 埋込みと顕微鏡試料作製
    1. TBSからスライドを取り出し、ペーパータオルでスライドを横に叩いて余分な水分を取り除きます。
    2. 15-20μLの封入剤を添加します。清潔なカバースリップを端で保持し、一方の端をティッシュの反対側に置き、その間に封入剤を挟みます。
    3. カバーガラスをゆっくりと下げて、培地が組織全体に均等に広がるように、気泡が引っかからないように注意します。
    4. タスクワイプを使用して、端の周りの過剰な封入媒体を吸収します。顕微鏡検査に進む前に、完成したスライドを室温で暗所で乾燥させます。残りのスライドについても、このプロセスを繰り返します。

結果

成体野生型(WT)マウスおよびMT-TGFαマウスは、孝孕化の2週間前に飲料水中に硫酸亜鉛(25 mM ZnSO4)を投与されました。WTマウスの胃は、肉眼的にも組織学的にも正常であるように見えました。対照的に、MT-TGFαの胃は著しく肥厚していました(図2A)。顕微鏡的には、これらの胃は、頭頂細胞と主細胞の両方を失った大規模な中心窩過形成を示し(図2B-D)、メネトリエ病(MD)の組織学的特徴を再現しています。主細胞の喪失は、主細胞の死または主細胞から生じる鎮痙性ポリペプチド発現化生(SPEM)の2つの異なる方法で発生する可能性があります。これら2つの可能性を区別するために、Mist1-CreERT2を交配することにより、主要細胞の系統追跡を行いました。R26-LSL-mTmGマウスとMT-TGFαマウス。これらのマウスは、最初に低用量のタモキシフェン(37.5 mg / kg腹腔内7日間連続)で処理して、主細胞をGFPで標識し、次に飲料水中のZnSO4でTGFαの過剰発現を誘導しました。MT-TGFαマウスでまれなGFP標識細胞を観察しました(データは示されていません)。さらに、MT-TGFαマウスでは、ZnSO4 の存在下または非存在下で、肉眼的および組織学的差はありませんでした(図3A-C)。この発見について考えられる説明の1つは、TGFαがチーフ細胞18の必須転写因子であるMist1の発現を減少させ、Mist1-CreERT2対立遺伝子の有用性を損なった可能性があることでした。実際、ZnSO4処理をしていないMT-TGFαマウスでは、Mist1の免疫組織化学的染色が失われました(図3D)。

MT-TGFαマウスモデルのリークロスを克服するために、ドキシサイクリン誘導性Doxi-TGFaトランスジェニックモデルに目を向けました。これは、TetO−TGFαマウス14をCMV−rtTAマウス系統13に交配させることによって達成された;rtTAは胃で発現することが以前に報告されています。この新しいMDマウスモデルでは、2週間のドキシサイクリン治療により中心窩過形成が誘発され、頭頂細胞と主細胞の数が減少することを確認しました(図4A-C)。MT-TGFαマウスの組織形態学的特徴と比較して、Doxi-TGFαマウスは、重度の粘膜の厚さと中心窩の過形成が少なく、頭頂細胞の減少も少なかった(補足図2)。それにもかかわらず、Mist1-CreERT2マウス系統を用いてチーフ細胞の系統をトレースすることができ、チーフ細胞の系統もGSIIおよびCD44v9で標識されていることを確認しました20,21、TGFαの過剰発現がチーフ細胞からSPEMを誘導することを確認しました(図4D)。

現在の研究では、MT-TGFαマウスモデルが、プロモーター/エンハンサーの内在的な漏れおよび/または重金属曝露を回避できないため、重金属処理がない場合にMDの組織病理学的特徴を表現コピーすることが示されています(図3 および 補足図2)。TGFαはMist1の発現を抑制するため、Mist1-CreERT2マウス系統はMT-TGFαマウスモデルでは使用できません。私たちは、ドキシサイクリン処理によりTGFαの発現を誘導できる新しいMDマウスモデルを作成しました。この新しいDoxi-TGFα MDマウスモデルを用いて、TGFαの過剰発現がチーフ細胞由来のSPEMを誘導することを確認しました。Doxi-TGFα MDマウスモデルは、TGFαの発現を精密に制御する必要がある場合や、Mist1-CreERT2マウス系統を用いて主細胞の遺伝子改変が必要な場合に役立ちます。

データの可用性:

すべての生データは、補足ファイルとして利用できます。

figure-results-2258
図1:胃組織包埋の固定と調製のためのワークフロー (A)十二指腸の短いセグメント(3-5 mm)とともに胃を解剖します。(B)ピペットチップ付きの注射器を使用して十二指腸からPBSを点滴し、指で3倍絞って管腔内容物を取り除きます。(C)注射器を使用して十二指腸からホルマリンで胃を膨らませ、胃十二指腸接合部をつまんでホルマリンを保持します。(D)胃をホルマリンに浸し、振とうしながら4°Cで一晩固定します。(E)カミソリの刃で前胃と十二指腸を切除し、PBSですすいでください。(F)胃体と前庭部を断面的に3〜4個のリングに切断し、2%アガロースに埋め込むことで、胃組織リングの配向を維持します。(G)アガロースに包埋された組織をカセットに入れます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3030
図2:重金属ZnSO4で処理したMT-TGFαマウスの肉眼的および顕微鏡的表現型。 (A)MT-TGFαマウス(右)は対照マウス(左)に比べて胃壁が厚い。(B)MT-TGFαマウス(右)の胃は、大規模な中心窩過形成と壁細胞の喪失を示しています。黄色の矢印は頭頂細胞を示し、緑色の矢印は中心窩細胞を示します。(C)免疫蛍光染色により、MT-TGFαマウス胃(右)は、対照マウス胃(左)と比較して、中心窩細胞(UEA1陽性)およびSPEM細胞(GIFおよびGSIIダブルポジティブ)の数が増加し、頭頂細胞(H+/K+-ATPase陽性)およびチーフ細胞(GIFシングルポジティブ)の数が減少していることが確認されています。(D)ZnSO4(n = 5)で処理した野生型(WT)マウスおよびZnSO4(n = 3)で処理したMT-TGFαマウスにおける異なる上皮細胞タイプと粘膜の厚さの定量化。エラーバーは標準偏差を示します(**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3903
図3:MT-TGFαマウスは、重金属処理なしで胃の表現型を発症します。 (A)MT-TGFαマウス(右)の胃は、重金属処理なしで大規模な中心窩過形成と壁細胞の喪失を示しています。黄色の矢印は頭頂細胞を示し、緑色の矢印は中心窩細胞を示します。(B)免疫蛍光染色により、重金属処理をしていないマウス胃MT-TGFαマウス胃(右)は、対照マウス胃(左)と比較して、中心窩細胞(UEA1陽性)およびSPEM細胞(GIFおよびGSIIダブルポジティブ)の数が増加し、頭頂細胞(H+/K+-ATPase陽性)およびチーフ細胞(GIFシングルポジティブ)の数が減少していることが確認されました。(C)ZnSO4を含まないWTマウス(n = 5)およびMT-TGFαマウスZnSO4(n = 3)における異なる上皮細胞型および粘膜厚さの定量化。エラーバーは標準偏差(***p < 0.001、****p < 0.0001)を示します。(D)MT-TGFαマウスの胃(右)は、通常、主細胞(左)で発現するMist1の発現が失われていることを示しています。GSIIは、頸部粘膜細胞のマーカーです。スケールバーは100μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4830
図4:ドキシサイクリン誘導性TGFαマウスモデル(Doxi-TGFα)は、メネトリエ病の表現型を再現し、このマウスモデルでSPEM形成が確認されています。TetO-TGFαマウス(Doxi-TGFα;右)は、大規模な中心窩過形成と頭頂細胞数の減少を示しています。黄色の矢印は頭頂細胞を示し、緑色の矢印は中心窩細胞を示します。(B)免疫蛍光染色により、Doxi-TGFαマウス胃(右)は、対照マウス胃(左)と比較して、中心窩細胞(UEA1陽性)およびSPEM細胞(GIFおよびGSIIダブルポジティブ)の数が増加し、頭頂細胞(H+/K+-ATPase陽性)およびチーフ細胞(GIFシングルポジティブ)の数が減少していることが確認されました。(C)WTマウス(n=5)およびDoxi-TGFαマウス(n=5)における異なる上皮細胞型および粘膜厚さの定量化。エラーバーは標準偏差(*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)を示します。(D)Mist1-CreERT2を使用した主細胞(GFP陽性)の系統追跡。R26-LSL-mTmGマウスラインは、GFP陽性細胞がDoxi-TGFαマウス胃のGSIIおよびCD44v9に対しても陽性であることを明らかにし、主要な細胞に由来するSPEM形成を確認しますが、対照胃(左)は、GSIIまたはCD44v9に対しても陽性のGFP陽性細胞がほとんどないことを示しています。スケールバーは100μmを表しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:低用量タモキシフェン(TMX)治療は胃粘膜損傷を誘発しません。 7日間連続の低用量TMX治療(37.5 mg / kg)は、頭頂細胞数の維持に代表されるように、胃粘膜損傷を引き起こさないものとします。.(A)TMX処理なし(左パネル)とTMX処理あり(右パネル)の代表的なH&E画像。(B) WTマウス(n = 5)およびTMX処理(n = 5)を実施したWTにおける胃単位あたりの壁細胞数の定量化。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:異なるメネトリエ病(MD)マウスモデル間の表現型の比較。 (A)ZnSO4処理を施したMT-TGFα、ZnSO4 処理を施さなかったMT-TGFα、およびDoxi-TGFα MDマウスモデルは、中心窩過形成、頭頂細胞および主細胞の喪失、鎮痙性ポリペプチド発現化生(SPEM)細胞(GIFおよびGSII共局在細胞)の増加、および粘膜の肥厚を示しています。MT-TGFα ZnSO4 治療群の有無と併用との間に表現型の差はありません。Doxi-TGFαマウスモデルは、MT-TGFαマウスモデルよりも重症度の低い表現型を示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

メネトリエ病(MD)は、TGFαの過剰発現によって引き起こされるまれな前がん性胃疾患です1,2,3。メタロチオネイン遺伝子エンハンサー/プロモーター(MT-TGFα)の制御下でTGFαを過剰発現するトランスジェニックマウスは、これまでMDの唯一のマウスモデルでした4,5。メタロチオネイン遺伝子は重金属応答性であるため、このマウスモデルでは、飲料水に硫酸亜鉛を添加するか、硫酸カドミウムを注入してTGFαを誘導します5,8。MDの特徴的な表現型の1つは、胃腺の基部にある主細胞が、粘膜頸部細胞と胞状ムチン細胞の両方に存在するマーカーに陽性の粘液性細胞によって置換されることです。これは、主細胞の死滅または主細胞の痙攣性ポリペプチド発現化生(SPEM)への再プログラミングのいずれかによって起こり得る8,11。これは、MDマウスモデルにおける主細胞の系統追跡によってテストできます。私たちは、Mist1-CreERT2を使用して主要な細胞の系統追跡を試みました。Mist1陽性主細胞をメンブレン標的GFPで標識したR26-LSL-mTmGマウス。しかし、MT-TGFαマウスでは、限られた数のGFP標識細胞しか観察されませんでした。このことは、GFP標識されたチーフ細胞のほとんどがTGFαの過剰発現により死滅したか、またはチーフ細胞におけるGFP標識の効率が低すぎたことを示唆しています。TGFαの過剰発現8による細胞死の増加は認められていないことから、重金属処理をしていないMT-TGFαマウスを評価することで、Mist1の発現喪失の可能性を検討しました。重金属処理をしていないMT-TGFαマウスでは、中心窩過形成や頭頂細胞および主細胞の喪失など、完全な表現型に驚きました。また、MT-TGFαマウスでは重金属処理をしなくてもMist1の発現が失われることを確認しました。MT-TGFαマウスでは、重金属への曝露を排除できないため、TGFαの発現が厳密に制御されていなかったことが以前に報告されています。しかし、TGFαの発現は重金属処理によって有意に増加しました8。包括的な表現型評価は、重金属処理なしでMT-TGFαマウスでこれまでに行われていませんでした。現在の研究では、MT-TGFαマウスが重金属処理なしで完全な表現型症状を発症することが示されています。

MT-TGFαマウスでは重金属処理前でもMist1の発現が失われていたため、TGFαの過剰発現を誘導せずに表現型が進行しないようにTGFαの発現を特異的に制御した別のマウスモデルが必要でした。私たちは、ドキシサイクリン処理によりTGFαの発現が誘導される新規のMDマウスモデル(Doxi-TGFα)を作製しました。このマウスモデルでは、MDの主要な表現型である中心窩過形成と頭頂細胞および主細胞の喪失を誘導することを確認しました。Mist1-CreERT2を使用してチーフセルの系統をトレースすることができました。このマウスモデルでR26-LSL-mTmGマウスを使用し、一部のGFP標識細胞がGSIIおよびCD44v9でも標識されていることを発見し、この新しいMDマウスモデルでSPEMが起こることを確認しました。これは、SPEMがTGFαの過剰発現により胃内で発生することを確認した最初の報告です。SPEMはより一般的な前がん性胃疾患であり、これがMD患者で胃がんが増加する理由である可能性があります22,23。

Mist1-CreERT2マウス系統を用いることの注意点の一つは、Mist1が胃幹細胞24でも発現することが報告されているということである。低用量(37.5 mg / kg)のタモキシフェン治療は、ドキシサイクリン治療の前の早い時点でも、峡部領域での活性化を最小限に抑えて、より具体的には主要な細胞でCreの活性化を誘導することがわかりました。同様の知見は以前にも報告されている25。Mist1-CreERT2を用いた系統追跡;R26-LSL-mTmGマウスは、GFPおよびSPEMマーカー(GSIIおよびCD44v9)のダブル陽性細胞が主に主細胞が位置する塩基に局在するGFP陽性細胞を示しています(図4C)。GFPマーカーとSPEMマーカーのダブル陽性細胞を幹細胞から追跡すると、幹細胞が位置する峡部に向かってGFP陽性細胞がもっと存在していたはずです。あるいは、ドキシサイクリン誘導性GIF-rtTAマウス26 系統またはGPR30-rtTAマウス27 系統をMT-TGFαマウスと共に、主細胞の遺伝子改変または系統追跡に使用することができる。しかし、ZnSO4処理をしていないMT-TGFαマウスではGIF陽性細胞が減少し(図3B、C)、SPEMではGPR30陽性細胞が失われ、これはZnSO4処理をしていないMT-TGFαマウスで発生します。したがって、Mist1-CreERT2マウス系統と交配したDoxi-TGFαマウスと比較して効率が低くなります。

現在の研究では、MT-TGFαマウスは、重金属処理なしで胃に完全な表現型の変化を発症することが示されています。また、表現型の1つがMist1の発現の喪失であり、これがMist1-CreERT2の使用を妨げることも示しています。R26-LSL-mTmGマウス系統から系統トレースチーフセルへ。私たちは、新規MDマウスモデルであるDoxi-TGFαを作製し、このマウスモデルを用いてSPEMがMDで発現することを初めて確認しました。この新しいMDマウスモデルは、MD表現型の発達を正確に制御する必要がある場合や、Mist1-CreERT2マウス系統を使用して主細胞の遺伝子改変が必要な場合に役立ちます。MD表現型は、TGFαの過剰発現によるEGFRシグナル伝達の活性化によって誘導されます。しかし、EGFRの活性化は不明であり、どの細胞型が観察された表現型に関与しているかは不明です。現在、Doxi-TGFαマウスモデルを用いて、Mist1-CreERT2マウス系統を利用する主要細胞を含む、さまざまな細胞種におけるEGFRシグナル伝達の役割を調査しています。

開示事項

すべての著者は、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(K08 DK124686からWJH)の支援を受けました。原稿を編集してくれたGina Della PortaとSarah E. Glassに感謝します。

著者の貢献:
TTGは実験を行い、図を作成し、原稿を書き、原稿を編集しました。JDPは実験を行い、図を作成し、原稿を書き、原稿を編集しました。SKMはTetO-TGFαマウスラインを提供し、原稿を編集しました。RJCは実験を考案し、原稿を編集しました。WJHは実験を考案し、実験を行い、データを解釈し、文献を検索し、原稿を書き、原稿を編集しました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse anti H+/K+-ATPase antibodyA gift from Dr. Eunyoung ChoiN/ADilution: 1:10000
Antibody DiluentAbcam559148
Anti-rabbit GFPLife Technologies CorporationA11122Dilution: 1:500
Charged Glass SlidesFisher22-178-277
Cover SlipsGlobe Scientific1411-10
Donkey anti-mouse 594InvitrogenA12102Dilution: 1:500
Donkey anti-rabbit 488InvitrogenA21206Dilution: 1:500
Donkey anti-rabbit 594InvitrogenA21207Dilution: 1:500
Donkey anti-rat 594InvitrogenA21209Dilution: 1:500
Doxyclycine HyclateTCID4116
Flouromount-GThermo fischer00-4958-02
GSII 488InvitrogenL21415Dilution: 1:500
Hydrophobic MarkerElectron Microscopy Sciences71312
IncubatorLabnetI 5110
MIST1/bHLHa15 (D7N4B) XP Rabbit mAbCell Signaling14896SDilution: 1:200
Pressure Cooker (6QT)CuisinartCPC-600N1
Protein BlockAbcamAB64226
Rabbit anti-GIF antibodyMyBioSourceMBS2028736Dilution: 1:200
Rat anti CD44v9 mAbCosmo BioLKG-M002Dilution: 1:20000
Slide JarsSimportM906-12AS
TamoxifenSigma-AldrichT5648
TrilogySigma922P-10-RUO
UEA1 Dylight 649Vector LaboratoriesDL-1068Dilution: 1:500

参考文献

  1. Huh, W. J., Coffey, R. J., Washington, M. K. Menetrier's disease: Its mimickers and pathogenesis. J Pathol Transl Med. 50 (1), 10-16 (2016).
  2. Tanksley, J. Jr, Tanksley, J. Pierre menetrier and his disease. Trans Am Clin Climatol Assoc. 123, discussion 133-124 126-133 (2012).
  3. Rich, A., et al. Distinguishing menetrier's disease from its mimics. Gut. 59 (12), 1617-1624 (2010).
  4. Takagi, H., Jhappan, C., Sharp, R., Merlino, G. Hypertrophic gastropathy resembling menetrier's disease in transgenic mice overexpressing transforming growth factor alpha in the stomach. J Clin Invest. 90 (3), 1161-1167 (1992).
  5. Dempsey, P. J., et al. Possible role of transforming growth factor alpha in the pathogenesis of menetrier's disease: Supportive evidence form humans and transgenic mice. Gastroenterology. 103 (6), 1950-1963 (1992).
  6. Fiske, W. H., et al. Efficacy of cetuximab in the treatment of menetrier's disease. Sci Transl Med. 1 (8), 8ra18(2009).
  7. Burdick, J. S., et al. Treatment of menetrier's disease with a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor. N Engl J Med. 343 (23), 1697-1701 (2000).
  8. Goldenring, J. R., et al. Overexpression of transforming growth factor-alpha alters differentiation of gastric cell lineages. Dig Dis Sci. 41 (4), 773-784 (1996).
  9. Sharp, R., et al. Transforming growth factor alpha disrupts the normal program of cellular differentiation in the gastric mucosa of transgenic mice. Development. 121 (1), 149-161 (1995).
  10. Bockman, D. E., Sharp, R., Merlino, G. Regulation of terminal differentiation of zymogenic cells by transforming growth factor alpha in transgenic mice. Gastroenterology. 108 (2), 447-454 (1995).
  11. Nomura, S., et al. Evidence for repatterning of the gastric fundic epithelium associated with menetrier's disease and tgfalpha overexpression. Gastroenterology. 128 (5), 1292-1305 (2005).
  12. Shi, G., et al. Loss of the acinar-restricted transcription factor mist1 accelerates kras-induced pancreatic intraepithelial neoplasia. Gastroenterology. 136 (4), 1368-1378 (2009).
  13. Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10933-10938 (1996).
  14. Hardie, W. D., et al. Conditional expression of transforming growth factor-alpha in adult mouse lung causes pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L741-L749 (2004).
  15. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (3), 365-367 (2019).
  16. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24.e7 (2012).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  18. Ramsey, V. G., et al. The maturation of mucus-secreting gastric epithelial progenitors into digestive-enzyme secreting zymogenic cells requires mist1. Development. 134 (1), 211-222 (2007).
  19. Huh, W. J., et al. Xbp1 controls maturation of gastric zymogenic cells by induction of mist1 and expansion of the rough endoplasmic reticulum. Gastroenterology. 139 (6), 2038-2049 (2010).
  20. Engevik, A. C., et al. The development of spasmolytic polypeptide/tff2-expressing metaplasia (spem) during gastric repair is absent in the aged stomach. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (5), 605-624 (2016).
  21. Wada, T., et al. Functional role of cd44v-xct system in the development of spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia. Cancer Sci. 104 (10), 1323-1329 (2013).
  22. Halldorsdottir, A. M., et al. Spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia (spem) associated with gastric cancer in iceland. Dig Dis Sci. 48 (3), 431-441 (2003).
  23. Yamaguchi, H., Goldenring, J. R., Kaminishi, M., Lee, J. R. Identification of spasmolytic polypeptide expressing metaplasia (spem) in remnant gastric cancer and surveillance postgastrectomy biopsies. Dig Dis Sci. 47 (3), 573-578 (2002).
  24. Hayakawa, Y., et al. Mist1 expressing gastric stem cells maintain the normal and neoplastic gastric epithelium and are supported by a perivascular stem cell niche. Cancer Cell. 28 (6), 800-814 (2015).
  25. Saenz, J. B., Vargas, N., Cho, C. J., Mills, J. C. Regulation of the double-stranded rna response through adar1 licenses metaplastic reprogramming in gastric epithelium. JCI Insight. 7 (3), e153511(2022).
  26. Caldwell, B., Meyer, A. R., Weis, J. A., Engevik, A. C., Choi, E. Chief cell plasticity is the origin of metaplasia following acute injury in the stomach mucosa. Gut. 71 (6), 1068-1077 (2022).
  27. Hata, M., et al. Gpr30-expressing gastric chief cells do not dedifferentiate but are eliminated via pdk-dependent cell competition during development of metaplasia. Gastroenterology. 158 (6), 1650-1666.e15 (2020).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

220

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved