植物のキューティクルの生合成を探検するシロイヌナズナeceriferum変異体の使用

要約

植物のキューティクルは、水の保全に主要な役割を持っているだけでなく、病原性微生物のエントリに対して重要な障壁である植物のワックス状の外装です。このビデオでは、我々は前方および逆遺伝学的アプローチによって識別される植物のクチクラの変異体の分析を示しています。

要約

植物のキューティクルは、水の保全の主要な役割を持つ植物のワックス状の外側のカバーですが、また、病原微生物の侵入に対して重要な障壁である。キューティクルは、"クチン"と呼ばれるタフな架橋ポリマーと保護ワックス層シール植物表面で構成されています。クチクラのワックス状の層は、ツタの葉の上に光沢のあるフィルムとして、またはブドウやワックスに存在する散乱結晶を光にキャベツの葉のおかげで表面上のほこりだらけの外装として表示されて、多くの植物で明白である。キューティクルは、陸生環境に対する植物の本質的な適応であるため、植物のクチクラの形成に関与する遺伝子を理解することは農業と林業の両方のアプリケーションを持っています。今日は、順方向と逆遺伝学的アプローチによって識別される植物のクチクラの変異体の解析を紹介します。

プロトコル

キューティクル変異体を同定するためにI.ビジュアル画面および逆遺伝学的アプローチ。

モデル植物のシロイヌナズナの表皮の変異体は、"ベアリングではないろう"を意味する"eceriferum"変異体、と呼ばれています。彼らはちょうど変異体を調べることで、つまり、視覚的な画面になることができますが、その変異体は、濃い緑色の光沢のある茎を持つ一方、野生型植物の花序茎が白っぽくなることがわかります。視覚的な画面のこのタイプで分離された変異体の一つは、この1つ、eceriferum4またはcer4と呼ばれる。

別の逆遺伝学のアプローチとなる興味深いキューティクルの変異を検出する方法：興味の選択の候補遺伝子とその遺伝子を植物系統を研究が中断。これらの変異体は、TDNA、このケースでは、我々は今MAH1を呼び出すことがチトクロームP450を目的とする遺伝子を破壊している。

PCRの結果は、（ビデオに示すような）TDNAの挿入が関心のある遺伝子にあることを確認することができます。つの遺伝子特異的プライマーは野生型DNAを増幅するために使用されるとき、我々は製品を参照してください、しかしTDNA割り込み場合は、この変異体のように、そこに商品がない。逆に、TDNAと遺伝子に特異的なプライマーを用いて、製品は、変異体で見られている。我々は、遺伝子の母親と父親の両方のコピーが中断されているホモ接合変異体のラインを探します。遺伝子のコピーは、TDNAによって破壊され、他のコピーがまだ野生型であり、PCRの結果が混在している場合。

II。 Cutlicleワックスの化学組成を決定するためにガスクロマトグラフィーを用いて。

我々は、ガスクロマトグラフィーを用いてワックスの化学組成を分析する。最初に、水溶性ワックスの化合物は、クロロホルムに浸漬することにより、植物の表面から除去されています。

それらを加熱してガスの流れ上を介して送信される場所にし、試料は、ガスクロマトグラフィーカラムに注入されています。別の化合物は化合物の分離、カラムの壁に多かれ少なかれスティック、およびそれらの列の他の端に次々に出てくる。化合物は水素炎イオン化検出器を通過するにつれて、我々はピークを参照してください。各ピークの保持時間が異なる化合物の特徴であると、質量分析から、我々はシロイヌナズナワックスの成分のそれぞれを同定した。主要なピークは存在C29アルカン、C29ケトンとC29二級アルコールのことです。マイナーピークは第二級アルコール、脂肪酸、アルデヒド及びエステルである。標準に対する相対ピーク下の面積は、、どのくらいの各化合物の存在である私達に伝えます。

これらのキューティクルの変異体からのガスクロマトグラムを見るとき、人はmah1が第二級アルコールおよびケトンを欠く状態にある間cer4は、第一級アルコールとエステルを欠く方法に気づくことができる。これらの表現型は、私たちに、植物における目的遺伝子の機能について多くを伝えることができます。例えば、我々はcer4ラインに変異した遺伝子知っていた前に、表現型は、生合成経路の第一級アルコールのブランチに問題があったことを私たちに語った。その遺伝子の分子識別はクンストラボで研究された後、それがこの化学物質の表現型とよく適合する脂肪酸アシル還元酵素の遺伝子ファミリーの一部であることが発見されました。

III。キューティクル結晶の構造を決定するためにクライオSEMを用いて

彼らは茎に暗緑色、光沢のある表現型又は野生型白っぽい外観を持っている場合我々はシロイヌナズナ表皮の変異体を研究するとき、我々が見ることができます。我々は、植物の表面にキューティクルを見て、視覚的な表現の基礎を識別するために、走査型電子顕微鏡を使用してください。我々は、SEMが動作する真空を必要とし、それらを冷凍保存せず、試料が乾燥し、崩壊してしまうので、キューティクルをそのまま保つために植物を凍結し、液体窒素温度でそれを表示し、低温SEMを使用してください。

ここcer4とmah1サンプルは、野生型コントロールと共に、SEMのスタブに解剖し、凍結されています。サンプルは顕微鏡のコールドステージに転送されるときは、野生型シロイヌナズナの茎の表皮の表面が結晶で覆われていることがわかります。それは、幹にその白っぽい外観を与えるそれらの結晶をオフに散乱される光です。ここcer4ステムは、それが光沢のある見て覚えてる？それは表面に結晶を欠いている。

人々は植物のキューティクルから純粋なワックスの化合物を分離し、彼らが実験室でそれを再結晶するとき、結晶は植物に見られるものと同じ形状を形成する実験を行っている。シロイヌナズナでは、我々は結晶化合物の混合物で構成され、状況はより複雑であると信じています。例えば、化学分析はcer4で、第一級アルコールとその誘導体のエステルの唯一のマイナーなコンポーネントが欠落していることを私達に示して、まだCE上での結晶R4幹がなくなっている。 mah1の場合は、そのシトクロムP450酵素の変異の影響は、変異体植物はワックス、第二級アルコールおよびケトンの2つの主要コンポーネントが欠けている、まだmah1植物で結晶が正常に形成することです。

シロイヌナズナ表皮の変異体についてさらに学びたい方は、アクセスしてください植物の生物学の年次レビュー 。