顕微鏡検査と染色:グラム、カプセル、内胞染色

ソース: リアノン M. ルベケ¹, ナタリア マーティン¹, アンドリュー J. ヴァン アルスト¹, ビクター J. ディリタ^1
1ミシガン州立大学微生物・分子遺伝学科、イーストランシング、ミシガン州、アメリカ合衆国

細菌は地球上のほぼどこにでも見られる多様な微生物です。多くの特性は、グラム染色の種類、形状と配置、カプセルの生産、胞子の形成を含むが、これらに限定されない、互いにそれらを区別するのに役立ちます。これらの特性を観察するために、1つは光顕微鏡を使用することができます。しかし、いくつかの細菌特性(例えば、サイズ、着色の欠如、屈折特性)は、光顕微鏡(1、2)だけで細菌を区別することが困難になります。細菌の種類を軽い顕微鏡で区別する場合は、染色細菌が必要です。2つの主要なタイプの軽微小顕微鏡は、シンプルで化合物です。それらの主な違いは、オブジェクトを拡大するために使用されるレンズの数です。単純な顕微鏡(例えば虫眼鏡)は、物体を拡大するためのレンズが1つしかありませんが、複合顕微鏡には倍率を高めるためのレンズが複数あります(図1)。複合顕微鏡は、物体の画像を作成するために光を収集するオブジェクトの近くに対物レンズを持っています。これは、画像を拡大するアイピース(眼レンズ)によって拡大されます。対物レンズとアイピースを組み合わせることで、単一レンズ単一レンズを使用するよりも高い倍率を実現します。通常、複合顕微鏡は、異なる倍率(1、2)を可能にするために、様々な力の複数の対物レンズを持っています。ここでは、グラム染色、カプセル染色、内胞汚れを用いて細菌を可視化する方法について説明します。

図1:典型的な化合物顕微鏡。顕微鏡の最も重要な部分は標識される。

デンマークの細菌学者ハンス・クリスチャン・グラム(1)によって1884年に開発されたグラム染色は、細胞壁(1、2、3、4)の組成に基づいて細菌を分化する。簡単に言えば、細菌のスミアを顕微鏡スライド上に置き、細胞をスライドに付着させ、より容易に汚れを受け入れられるように熱固定する(1)。熱固定サンプルはクリスタルバイオレットで染色され、細胞を紫色に変えます。スライドは、細胞壁にクリスタルバイオレットを固定するヨウ素溶液で洗い流され、その後、非固定クリスタルバイオレットを洗い流すためにデカラーライザー(アルコール)が続きます。最後のステップでは、カウンターステイン、サフラニン、赤色色セルに添加されます(図2)。グラム陽性細菌は、デカラーライザーによって容易に浸透しない厚いペプチドギリカン層に起因する紫色に染色します。グラム陰性菌は、その薄いペプチドギリカン層と高い脂質含有量を有し、脱色剤で脱染し、サフラニンを添加すると赤色に染色される(図3)。グラム染色は、細胞を2種類(グラム陽性とグラム陰性)に分化するために使用され、細胞形状(球体または球体、ロッド、曲面ロッド、スパイラル)と配置(単一細胞、ペア、チェーン、グループ、クラスター)を区別するのにも役立ちます(1,3).

図2:グラム染色プロトコルの概略図。左の列は、プロトコルの各ステップでグラム陰性細菌がどのように反応するかを示しています。右の列は、グラム陽性の細菌がどのように反応するかを示しています。また、図示されているのは、バチル(または棒)と球体(または球)の2つの典型的な細菌細胞形状である。

図3:グラム染色結果。黄色ブドウ球菌(グラム陽性紫色のコッカス)と大腸菌(グラム陰性赤い棒)の混合物のグラム染色。

いくつかの細菌は、カプセル(3、5)と呼ばれる細胞外粘性外層を産生する。カプセルは、表面や他の細菌への付着、乾燥からの保護、および咽頭症からの保護を含むが、これらに限定されない様々な機能を有する保護構造である。カプセルは、通常、95%以上の水を含む多糖類で構成されていますが、一部はポリアルコールとポリアミン(5)を含むことがあります。そのほとんど非イオン性組成物と汚れを撃退する傾向があるため、単純な染色方法はカプセルでは動作しません。その代わりに、カプセル染色は、細胞および背景を染色する負の染色技術を使用し、カプセルを細胞の周りに明確なハローとして残す(図4)。カプセル染色は、細菌サンプルを顕微鏡スライド上の酸性染色に塗りつぶすることを含む。グラム染色とは異なり、細菌の汚れはカプセル染色中に熱固定されません。熱固定は、カプセルを破壊または脱水することができ、偽陰性(5)につながる。さらに、熱固定は細胞を収縮させることができ、その結果、カプセルと間違えられ得る細胞の周りのクリアリングを行うことができ、偽陽性(3)を引き起こす。酸性染色は、スライドの背景を着色します。基本的な染色をフォローアップしながら、クリスタルバイオレットは、細菌細胞自体を着色し、カプセルを染色されず、細胞とスライドの背景との間に明確なハローとして現れる(図5)。従来、インドのインクは、これらの粒子がカプセルに浸透できないため、酸性染色剤として使用されてきました。したがって、カプセルも細胞もインドのインクによって染色されていない。代わりに、背景が汚されます。コンゴレッド、ニロシン、またはエオシンは、インドのインクの代わりに使用することができます。カプセル染色は、患者サンプルから培養物を見て、適切な患者治療を導くときに医師が細菌感染症を診断するのに役立ちます。封入細菌によって引き起こされる一般的な疾患には、肺炎、髄膜炎、およびサルモネラ症が含まれる。

図4:カプセル染色プロトコルの概略図。上部パネルは、汚れ塗布前のスライドスミアを示しています。中央のパネルは、スライドと細菌が一次染色、コンゴレッドの後にどのように見えるかを示しています。最後のパネルは、スライドと細菌がカウンターステイン、クリスタルバイオレットの後にどのように見えるかを示しています。

図5:カプセル染色結果。封入されたアシネトバクター・バウマンニ(黒い矢印で示される)および非封入大腸菌(白い矢印で示される)のカプセル染色。背景が暗く、A.バウマンニ細胞が紫色に染色されていることに注意してください。A.バウマンニ細胞の周りのカプセルはハローとして明らかであるが、大腸菌はハローを持たない。

有害な条件(例えば、栄養制限、極端な温度、脱水)では、一部の細菌は内在性胞子を産生し、物理的および化学的損傷に対して耐性のある代謝的に不活性な構造(1、2、8、9)を産生する。内胞子は、細菌が細胞の遺伝物質を保護することによって過酷な条件を生き残ることを可能にします。いったん条件が成長に有利な状態になったら、胞子は発芽し、細菌の増殖が続く。エンドスポールは、通常染色に使用される染料に対して不透過性であるため、標準的な染色技術では染色が困難です(1,9)。内胞子を染色するために日常的に使用される技術は、一次染色マラカイトグリーン、細胞材料に比較的弱く結合する水溶性染色、および熱を使用して、汚れを壊すことを可能にするシェーファーフルトン法(図6)です。胞子の皮質を通して(図7)。これらのステップは、成長する細胞(内胞子生物学の文脈で栄養細胞と呼ばれる)、ならびに内胞子および任意の自由胞子(もはや前の細胞の封筒内になくなっているもの)を着色する。栄養細胞は、マラカイトグリーンを除去するために水で洗浄されます。内胞子は胞子内のマラカイトグリーンを加熱することに起因する汚れを保持します。最後に、栄養細胞をサフラニンで逆染色して可視化する(図8)。エンド胞子の染色は、細菌を胞子原型および非胞子フォーマーに分化させるだけでなく、胞子がサンプル中に存在するかどうかを決定するのに役立ち、もし存在する場合、発芽時に細菌汚染を引き起こす可能性がある。

図6:内胞染色プロトコルの概略図。左の列は、胞形細菌がプロトコルの各ステップでどのように反応するかを示しています。右の列は、非胞毛形成細菌がどのように反応するかを示しています。

図7:内胞構造図種々の胞直構造を標識した内胞を含む細菌細胞。

図8:内胞染色結果。バチルス・サビリスのエンドスポ胞の典型的な染色.栄養細胞(白い矢印で示される)は赤く染色され、内胞子(黒い矢印で示される)は緑色に染色されます。

1. グラム染色

1. セットアップ
   1. 染料が手や衣類を汚すので、手袋と不燃性のラボコートを着用してください。
   2. ブンゼンバーナーは、細菌を加熱するために使用されます。炎を扱うときは注意してください。長い髪を結び返す
   3. 市販のグラム染色試薬が使用されます。
   4. 実験室のワイプが付いているきれいな顕微鏡のスライド。
2. プロトコル
   1. ピペ状10μLリン酸塩緩衝生理食生または培養ブロスをスライド上に置く。
   2. 細菌のコロニーを液体に塗りつぶし、薄い均一層を作り出す。
      注:細菌がグラム染色結果に影響を与える細胞壁に変化を持つことができるので、24時間より古い培養物を使用しないでください(1、4)。
   3. 完全に空気乾燥スライド。
   4. 乾燥したら、炎(細菌側上)を通してスライドを通過させて熱修正細菌を4

細菌は、その同定に役立つことができる特徴を持っています。これらの特性のいくつかは、染色および光顕微鏡検査によって観察することができる。これらの特性を観察するのに有用な3つの染色技術は、グラム染色、カプセル染色、およびエンドスポア染色である。各技術は、細菌の異なる特性を識別し、医師が患者のための治療を推奨し、サンプルや食品中の潜在的な汚染物質を特定し、...

1. Black, J. G. Microbiology Principles and Explorations, 4^th edition. Prentice-Hall, Inc., Upper Saddle River, New Jersey. (1999)
2. Madigan, M. T. and J. M. Martinko. Brock Biology of Microorganisms, 11^th edition. Pearson Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey. (2006).
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