この作業に貢献し、ほとんどがカフリーの膜構造機能生物学研究グループ、両方過去と現在のメンバーからなる人も多い。すべてに私たちは暖かいおかげと感謝の意を表する。この作品は、科学財団アイルランド（07/IN.1/B1836）、国立衛生研究所（GM75915）、およびリムリック大学からの補助金によって部分的にサポートされていました。

構造と機能生物学の分野における重要な焦点は、生物膜（図1）です。現在のセルとサブ細胞小器官を囲む膜は、単に2つの脂質分子を介して分子的に薄い構造であり、タンパク質が点在する。などの脂質とタンパク質の両方に適用される構造や機能が注目されている。しかし、この記事の焦点は、膜タンパク質に限定されています。 膜タンパク質は、分子レベルでどのように機能するかのより良い理解は、次の2つの理由のため求められている。まず、その仕組みを知ることに知的な満足感があります。第二に、タンパク質がどのように機能するかを知ることで、それをすべき修正することができるという見通しに誤動作または特定のアプリケーションのためにそれを変更しても改善するかのが常にあります。薬物設計は、この種の作業の明らかな結果である。膜タンパク質は、分子レベルでどのように動作するかを把握するためのひとつのアプローチは、その構造を決定することです。これは、タンパク質を構成するすべての原子の3次元空間における位置、または少なくともすべての非水素原子を、確立します。我々はこの目的のために使う方法は、高分子X線結晶構造（MX）です。図2は、構造MXを使用して決定された膜タンパク質の例を示しています。蛋白質の回折品質結晶がMXを実行する必要があります。 明らかに、高分子結晶学を用いて構造決定に関わる多くのステップがあります。これを図3に示されています。通常、これらは膜タンパク質のターゲットを識別し、生産、精製して結晶化が含まれます。回折の測定は、家庭やシンクロトロンX線源を用いて結晶上で実行されます。回折データは、分子モデルを搭載している電子密度マップをもたらして処理されます。洗練されたモデルは、、蛋白質の作用のメカニズムを探求し、構造ベースの薬剤設計のために使用することができます。 この記事の焦点は、 メソメソッドで 、いわゆるによって、我々は脂質中間相を用いた膜タンパク質の回折品質の結晶を作る方法を示すことです。最近の方法の見直しとその範囲はリファレンス1（カフリー、2009）で利用可能です。我々はここに続くステップバイステップのプロトコールは、リファレンス2（カフリーとCherezov、2009）に記載されています。 メソの膜タンパク質の結晶化実験での設定に必要な、時間に関連する手順をまとめたフローチャートを図4に示されています。この記事では、赤い破線の線で囲まれたこれらのステップをカバーしています。 第1部：結晶化プレートの準備<ol><li>作業台上にシラン化顕微鏡のスライドを置きます。 </li><li>穿孔ダブルスティックスペーサテープのストリップの一方の表面から保護紙のカバーを取り外します（市販の、以下の具体的な試薬および器具の表を参照）。 </li><li>スライドの表面に接触し、テープ、粘着面を下に置きます。 </li><li> brayerやローラーを使用してスライドするためにテープを圧力シール。アルミ箔は、テープと井戸の底を保護するためにローラーの間に配置することができます。 </li><li>その上側の粘着面を露出させるテープから第二紙のカバーを取り外します。 </li><li>ローディングが完了するとすぐに井戸の迅速かつ効率的なシーリングのためのプレートに近接して個々のシラン化カバースリップを配置。 </li></ol>第2部：準備脂質シリンジ<ol><li> 45温度制御されたブロック内の脂質（多くの場合、モノオレインを）置き℃で3分間は、溶融レンダリングする。 </li><li>脂質は、脂質、タンパク質の混合工程で使用するために2つの100μLガスタイトハミルトンシリンジを準備溶けている間。タンパク質溶液を含むシリンジからテフロンフェラルを取り外します。 （代わりにそのフェルールを残して）その横に脂質を保持する注射器を置きます。 </li><li>脂質の注射器に（具体的な試薬および器具以下と参考文献3（Cheng ら 、1998）の表を参照）カプラーを接続します。注射器にカプラーを指で締めますが締めすぎないでください。脂質のシリンジのバレルからプランジャーを外します。 </li><li>脂質は、先に進む前に溶融する必要があることに注意してください。 30μLにピペットを設定し、徐々に溶融脂質の約30μLを取る。ゆっくりすることができますようにエアギャップを導入しないように注意しながら注射器の開放端に溶融脂質をできるだけ多く提供する。 </li><li>溶融脂質と接触してバレルにプランジャーを置き、ゆっくりとシリンジビデオで示すように垂直に保持してバレルアッププランジャーを進めます。誤ってトラップされる気泡は、プロセスに上昇する必要がありますし、リリースされる。 </li><li>慎重にシリンジバレルのマーキングを読み取ることでシリンジ内の脂質の量を決定する。 </li><li> FERRをスライドさせカプラから伸びる針上にULE。バレルの上、ゆっくりと優しくカプラーの中核にある針に溶融脂質を強制的にプランジャーを使用してください。 </li></ol>パート3：タンパク質のシリンジを準備<ol><li>タンパク質溶液は4℃、5〜10分間、14,000 gで回転させてください° Cは、結晶化の試験を設定する前に、大きな凝集体を除去する。氷からのタンパク質溶液を除去し、室温で平衡化することができます。 </li><li>でキュービック相を形成したり、完全に水和して閉じるには、使用するタンパク質溶液の体積を計算します。モノオレインのために20℃、水で完全に水和が相図5（図5）のように約40％の水（質量）で行われます。 </li><li> 25または50μLハミルトンシリンジでタンパク質溶液の必要量を取る。気泡をしないように注意しながらタンパク質の注射器のバレルのプランジャーのテフロンチップ上に溶液を移す。 </li><li>慎重に針を撤回し、シリンジ内のタンパク質溶液の体積を測定する。それは前のステップで提供されている値と一致する必要があります。 </li><li>徐々にその開放端と同じ高さを終わらせるバレルまでのタンパク質溶液をインチ。 </li><li>脂質のシリンジに接続されているカプラーの開放端にタンパク質の注射器をねじ込みます。それは、デバイスが過度に締め付けることではないことが重要です。以上の締めはこの段階で組み立てられた混合装置は、フェルールを損傷し、漏れが発生します。下の締めは、また漏れにつながる。 </li></ol>パート4：ミキシングタンパク質溶液と脂質：メソフェーズを作る<ol><li>混合効果に、カプラを介して脂質の注射器に、タンパク質の注射器のタンパク質溶液を駆逐親指または人差し指で、その限界に組み立てられた混合ユニットの蛋白質側のプランジャーを進めます。 </li><li>脂質側のプランジャーは今カプラを介してタンパク質の注射器に戻って脂質の注射器の中身を駆動するために使用されます。 </li><li>プロセスは何度も繰り返され、時折、百通路以上の均一な中間相を生成するために必要とされています。ミキシングの開始時に、カプラを介して前後に材料の動きは常に、余分な力が混合効果に必要とされる、不均一であるとすることができます。最初の混合は通常、サンプルの不均一な曇りの発展を伴っている。均質化が進むにつれ、新興キュービック液晶相の視覚的な外観が行うように、テクスチャは、より均一と粘性立方相の特徴となります。 </li><li>条件が適切であり、立方晶の形態である場合、分散は、シリンジバレルの光学的に透明に表示されます。従って、シリンジバレルのマーキングがバレルの中間相を介して明らかに読みやすいはずです。 </li><li>氷の上に短い時間のために注射器のミキサーを配置することにより、混合時のサンプルの非常にわずかな冷却は、均質化と透明性の達成を加速することができます。しかし、それはサンプルを過冷しないことが重要です。 </li><li>注意これはサンプルの温度は摩擦発熱は3〜のため上昇する原因となりますので、ミキシング非常に活発なを避けるために注意すべきである。 </li></ol>パート5：ディスペンサーのロード<ol><li> 10μLハミルトンシリンジから針とプランジャーを外します。場所にテフロンフェラルを残す。 </li><li>小さなコインの助けを借りて、ディスペンサーから固定ナットを取り外します。 </li><li>ラチェットアームが完全に撤退して、注射器を挿入する - そのプランジャーと針なし - ディスペンサーの保持リングを介して。 </li><li>シリンジが直面している固定ナット、ガスケットの側を交換し、シリンジの開放端にしっかりとそれをねじ込む。 ケアは、シリンジが正しく保持リングの中心にされており、バレルがラチェットアームに平行に整列されていることを確認することも必要となります。両方とも、目で判断することができる。これらの2つの要件は、漏れを避けるために重要です。 </li><li>グリッパーのナットが数回転緩めるとグリップリングを介してプランジャを通過し、注射器の開放端にプランジャーをご案内。完全にラチェットアームを押し下げる。バレルにプランジャーを移動し、それがバレル内で自由と真の移動することを確認してください。それは自由に移動するプランジャーを容易にするために、ガイドバーのネジを緩めるのに役立つことがあります。それがないことを確認してください。そのテフロンチップがバレルのゼロμL目盛り線と揃うまで、プランジャーを押し下げ。ガイドバーのネジが緩んでいた場合、それを締めて、プランジャが自由に動くことを再チェック。 </li><li>他の注射器およびカプラーに中間相を転送するためにゼロμL目盛り線に組み立て混合ユニットの一方の側にプランジャーを移動します。 </li><li>混合ユニットから空の注射器を（代わりに、そのフェルール付き）を外し、すぐにロードされた注射器を接続する - カプラーとttached - 10μL分注シリンジのスレッド終了する。カップリングが行われるとの緊張の度合いは、すでに言及したように、非常に重要です。 </li><li>カプラを介して中間相の転送ができるよう、100μLシリンジのプランジャーを押し下げて、調剤シリンジをロードします。 </li><li>調剤シリンジの鋼の終了に短く、平らな先端の針を固定し、慎重に場所でそれを締めてください。 </li><li>グリップリングのナットを締めて、ラチェットアームにプランジャーをクランプ。注意これはそれが使用不能にプランジャーを獲得して変形できるように、ナットを締めすぎないように注意してください。クランプ状態でラチェットアームに提供される情報の範囲は、ビデオで示さインチ、以下に制限することが重要です。これを超えて、プランジャーは、座屈と配信が失敗することができる傾向を持つことになります。 </li><li>それによって針の空隙容積を充填し、針をロード、バレルにプランジャーを進めるためにラチェットのドラムを数回握り。このステップは、中間相の連続した​​文字列は、針の先端から出てくるまで（最大10回）繰り返される必要があります。 </li><li>いくつかのタンパク質が追加された沈殿剤なしでキュービック相で不安定であるため、結晶化の試験は、直ちに開始すべきである。 </li></ol>第6部：結晶化プレートを設定する<ol><li>表面にマルチウェル結晶化プレートとカバースリップを置き、ローディングを容易にするためのワークベンチ上に数センチを提起した。表面が少し暗いときに最適なコントラストと強化された可視性を実現している。 </li><li>沈殿剤のソリューションをホモジナイズし、バイアルを外す。 1μLに沈殿剤調剤のピペットを設定します。 </li><li>片手で垂直に開催された調剤の注射器で、中央に、直接よく番号1の塩基上記針の先端を配置するためにフリーハンドを使用してください。ガラスの表面に中間相のボーラスを追放するために繰り返しディスペンサーのボタンを押してください。ボーラス量は標準的な繰り返しディスペンサーが10 -μLシリンジで使用されている200 NLです。針の先端には、適切な配信を保証するために、ウェルのベース上に数百マイクロメートルを超えてはならない。 </li><li>隣接する4ウェルをメソフェーズ、2μLピペットと標準使い捨てチップを使用して、各メソボーラスの上に沈殿剤溶液の代わりに1μLがロードされた後。 </li><li>迅速に可能な限り、一様にそれらをカバーするために満たされた井戸を介して直角にカバースリップを配置。防水シールを有効にするには、それはスペーサーテープの露出粘着面に接触するカバースリップには押す力を加えないようにヘラを使用してください。 </li><li>プレート上のすべてのウェルがロードされ、密封されるまで、中間相および沈殿剤ディスペンシング工程を繰り返すことができます。 </li><li>追跡の目的のために明らかにプレートにラベルを付けます。光感受性タンパク質は通常、インキュベーションチャンバ内に配置する前アルミ箔でプレートをラップすることによって処理されます。 </li><li>通常20℃、温度制御チャンバー内にプレートを置く℃に</li><li>定期的なスケジュールで、10または20倍を目的とした偏光顕微鏡を用いて結晶成長のために井戸を検査。 0日目、1、2、3、5、7、14、21、30と60のセットアップ後に以下のように著者の研究室で使用されているスケジュールはありません。慎重に0.14 mm厚のサンプルの中で焦点深度を調節するメソフェーズボーラスを点検。検査は、通常の光と交差偏光子間の両方に行う必要があります。 </li></ol>パート7：代表的な結果得られた結晶の外観は、膜タンパク質の本来の色、検査（またはその欠如）と照明の方法と品質のために使用される光の偏光によって変化する。図6は、いくつかの可能な結晶の外観を示しています。通常の光で見たときメソで成長して自然に着色された膜タンパク質は、図6（パネルBおよびD）に示すもののようになります。通常の光で見たとき立方相で成長している無色の膜タンパク質の結晶は、図6（パネルE）に示すもののようになります。最後に、偏光で見たときメソで成長している無色の膜タンパク質の結晶は、図6（パネルAおよびC）のようになります。 構造決定の全体的なプロセスの次のステップは、収穫し、低温冷却結晶をして、そこからX線回折を記録して分析することです。これらのトピックは個別のJoveの記事でカバーされることがあります。 <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="図1" /> 図1にしている上に脂質二重層を示す生体膜の模式図は、タンパク質の様々な場所に位置しています。 <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。構造ビタミンB 12の輸送蛋白質、BtuBから、MXとこのJoveの記事に示されているメソ法6 のことで成長した結晶を用いて解く。 <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：構造と機能のサイクルは、蛋白質についての完全な構造情報を取得し、利用に必要な手順の多くを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="図4" /> 図4のフローチャートは、 メソ法における法による膜タンパク質結晶の生成に関与する手順をまとめます。赤い破線で囲まれたそれらのステップのみがこのJoveの記事でカバーされています。参考資料2から。 <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。脂質（モノオレイン）/水システムの簡素化温度組成相図。結晶化の試験は20に設定されています° C脂質が40％の水分補給に水で飽和する場所。詳細な相図は文献5で利用可能です。 <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="図6" /> 図6。脂質中間相で成長している膜タンパク質の結晶。 （A）ビタミンB 12の輸送蛋白質、BtuB 6、（b）に集光性複合体II 7（C）アドヘシン/インベイシンOPCA 8、（D）バクテリオロドプシン9、膿から（e）の炭水化物トランスポーター。画像は、通常の光（B、D、E）とし、交差した偏光子（、c）の間に記録した。

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	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter,+BtuB,+at+1.95+A+resolution.">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin.">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li></ol>

立方相は、変数の数の変化で大幅に変更することができる繊細かつダイナミックな環境です。それはすべての潜在的な落とし穴を説明するマニュアルモードでのメソ結晶化試験でのセットアップの説明を与えることは不可能である。しかし、多くの困難は、高価なタンパク質溶液に適用する前に技法を実践し、そして混合時に注射器に加えられた圧力に調停を使うことによって回避することができます。正しく行えば、 メソの方法でタンパク質のさまざまな結晶を得ることができる、の数は絶えず増加しています。 メソ結晶化試験でのセットアップがここで与えられた説明は、マニュアルモードに焦点を当てています。プロセスはすることができ、多くの場合、結晶化条件の大規模スクリーニングを必要とするような場合には結晶化プレートの自動セットアップを容易にするために変更されます。

機械加工、独自のナローボアカプラ用*完全な詳細は、参考文献3に記載されています。

crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases

脂質中間相を使用して膜タンパク質を結晶化するための詳細なプロトコルが記述されています。このメソッドは、様々に脂質キュービック相としてまたはメソの方法で呼ばれています。メソッドは、X線原核生物と真核生物のタンパク質の結晶構造、単量体であるタンパク質、ホモとヘテロ多量体、発色団含有し、発色団を含まない、とアルファを解決するために使用されているという点で非常に汎用性であることが示されている-ヘリカルとβ-バレルタンパク質。 メソ結晶化に使用しての最近の成功は、人間工学的β2-アドレナリン作動性およびアデノシンA2a Gタンパク質共役受容体である。プロトコルは、モノオレインベースの中間相に膜タンパク質を再構成するため、および手動モードでの結晶化を設定するために表示されている。このような結晶の収穫など、全体的なプロセスの追加の手順は、将来のビデオの記事で対処すべきです。タンパク負荷の中間相を準備するために、手動で結晶化プレートを設定するために必要な時間は約1時間です。

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Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

ここで脂質中間相で手動での膜タンパク質の結晶化の試験を設定するにはカフリーの膜構造機能生物学研究グループに実装されたプロシージャが記述されています。

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

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29.8K ビュー.  Trinity College Dublin. ここで脂質中間相で手動での膜タンパク質の結晶化の試験を設定するにはカフリーの膜構造機能生物学研究グループに実装されたプロシージャが記述されています。

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The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

生物学

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

ゼブラフィッシュの開発時Photoconvertibleタンパク質を用いた細胞トラッキング

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

ハイスループットSHAPEを使用したRNA二次構造予測

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...