Nombreux sont ceux qui ont contribué à ce travail et la plupart sont de la membrane Caffrey structurels et du groupe de biologie fonctionnelle, les deux membres passés et présents. Pour tout ce que nous adressons nos plus vifs remerciements et son appréciation. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de la Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), les National Institutes of Health (GM75915) et l&#39;Université de Limerick.

Un objectif important dans le domaine de la biologie structurale et fonctionnelle est la membrane biologique (Figure 1). La membrane qui entoure la cellule et sub-cellulaire des organites lorsqu&#39;il est présent, est une structure moléculaire fine seulement deux molécules lipidiques à travers et est parsemée de protéines. Structure et fonction appliquée à la fois des lipides et des protéines d&#39;intérêt. Cependant, l&#39;accent de cet article est réservé aux protéines membranaires. Une meilleure compréhension de la façon dont les protéines membranaires de fonction au niveau moléculaire est recherché pour deux raisons. Premièrement, il ya la satisfaction intellectuelle de savoir comment ils fonctionnent. Deuxièmement, en sachant comment une protéine fonctionne, il ya toujours la perspective d&#39;être en mesure de fixer elle devrait le dysfonctionnement ou d&#39;améliorer, voire de le modifier pour des applications particulières. Conception de médicaments est un résultat évident de ce type de travail. Une approche pour trouver comment une protéine membranaire fonctionne au niveau moléculaire est de déterminer sa structure. Cela implique l&#39;établissement de l&#39;emplacement dans l&#39;espace en 3 dimensions de tous les atomes, ou au moins tous les atomes non hydrogène, qui composent la protéine. La méthode que nous utilisons à cette fin est macromoléculaires cristallographie aux rayons X (MX). La figure 2 montre un exemple d&#39;une protéine membranaire dont la structure a été déterminée en utilisant MX. Un cristal de qualité de diffraction de la protéine est nécessaire de faire MX. Clairement, il ya de nombreuses étapes impliquées dans la détermination des structures par cristallographie macromoléculaire. Ceci est illustré dans la figure 3. Typiquement, il s&#39;agit notamment d&#39;identifier une cible protéine membranaire, puis la production, la purification et la cristallisation. Des mesures de diffraction sont effectuées sur le cristal à l&#39;aide d&#39;une maison ou d&#39;un synchrotron source de rayons X. Les données de diffraction sont traitées donnant une carte de densité d&#39;électrons qui est ensuite équipé d&#39;un modèle moléculaire. Le modèle, une fois raffiné, peuvent être utilisés pour explorer le mécanisme d&#39;action de la protéine et de la structure basée sur la conception de médicaments. L&#39;objet de cet article est de montrer comment nous produisons de la qualité des cristaux par diffraction des protéines membranaires en utilisant mésophases lipidiques, par le soi-disant méthode de méso. Un examen récent de la méthode et son champ de référence est disponible en 1 (Caffrey, 2009). Le protocole étape par étape, nous allons suivre ici est décrite dans la référence 2 (Caffrey et Cherezov, 2009). Un organigramme récapitulant les étapes impliquées dans et le temps requis pour la mise en place d&#39;une protéine de la membrane méso essai cristallisation est montré dans la figure 4. Cet article couvre les étapes ci-joint par des lignes en pointillés rouges. Partie 1: Préparation des plaques de cristallisation <ol><li> Position une lame de microscope silanisées sur le banc de travail. </li><li> Retirez le couvercle de protection en papier d&#39;une surface d&#39;une bande de ruban adhésif perforé entretoise double (disponible dans le commerce, voir le tableau des réactifs et équipements spécifiques ci-dessous). </li><li> Placez le ruban adhésif, côté collant vers le bas, en contact avec la surface de la lame. </li><li> Pression-joint la bande à la diapositive en utilisant un Brayer ou au rouleau. Le papier d&#39;aluminium peut être placé entre le ruban et le rouleau à protéger la base du puits. </li><li> Retirez le couvercle du deuxième document de la bande pour exposer sa surface supérieure collante. </li><li> Placez des lamelles individuelles silanisé à proximité de la plaque d&#39;étanchéité rapide et efficace des puits dès que le chargement est terminé. </li></ol> Partie 2: Préparation de la seringue lipides <ol><li> Placez le lipide (souvent monooléine) dans un bloc à température contrôlée à 45 ° C pendant 3 minutes pour le rendre liquide. </li><li> Alors que la fonte des lipides est de préparer deux 100-uL étanche seringues Hamilton pour une utilisation dans l&#39;étape de mélange entre protéines et lipides. Retirez l&#39;embout en téflon de la seringue qui va contenir la solution de protéines. Placez la seringue qui tiendra le lipide à côté de lui (en laissant sa férule en place). </li><li> Branchez le coupleur (voir tableau des réactifs et équipements spécifiques ci-dessous et de référence 3 (Cheng et al., 1998)) à la seringue des lipides. Serrer le coupleur à la seringue, mais ne pas trop serrer. Retirer le piston du canon de la seringue de lipides. </li><li> Notez que les lipides doivent être fondus avant de procéder. Régler la pipette à 30 uL et prendre lentement jusqu&#39;à environ 30 uL de lipides fondus. Lentement offrir autant de lipides fondus comme vous pouvez dans l&#39;extrémité ouverte de la seringue en prenant soin de ne pas introduire les lacunes de l&#39;air. </li><li> Placez le piston dans le cylindre en contact avec le lipide fondu et avancer lentement le piston du canon avec la seringue tenue verticalement comme l&#39;a montré dans la vidéo. Les bulles d&#39;air qui peuvent être piégés par inadvertance devrait augmenter dans le processus et être libéré. </li><li> Soigneusement déterminer le volume de lipides dans la seringue par la lecture des marques sur le corps de la seringue. </li><li> Faites glisser le ferrdule sur l&#39;aiguille qui s&#39;étend de l&#39;attelage. Utilisez le piston pour forcer la fusion des lipides le baril et lentement et doucement dans l&#39;aiguille à la base de l&#39;attelage. </li></ol> Partie 3: Préparation de la seringue de protéines <ol><li> La solution de protéine doit être filé à 14000 g pendant 5 à 10 minutes à 4 ° C pour éliminer les gros agrégats, avant la mise en place des essais de cristallisation. Retirer la solution de protéines de la glace et le laisser se stabiliser à la température ambiante. </li><li> Calculer le volume de solution de protéine à utiliser pour former la phase cubique à ou près de l&#39;hydratation complète. Pour monooléine à 20 ° C, l&#39;hydratation avec de l&#39;eau se produit à l&#39;eau de près de 40% (en masse) comme dans le diagramme de phase 5 (figure 5). </li><li> Avec un 25 ou 50 uL seringue Hamilton prendra le volume nécessaire de solution de protéine. Transfert de la solution sur le bout du piston en téflon dans le barillet de la seringue de protéines en prenant soin d&#39;éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Soigneusement retirer l&#39;aiguille et mesurer le volume de solution de protéine dans la seringue. Il doit correspondre à la valeur apportée à l&#39;étape précédente. </li><li> Lentement pouces jusqu&#39;à la solution de protéines du baril de finir au ras de son extrémité ouverte. </li><li> Visser la seringue à la protéine dans l&#39;extrémité ouverte de l&#39;attelage fixée à la seringue des lipides. Il est essentiel que l&#39;appareil ne soient pas trop serrés. Un serrage excessif du dispositif assemblé mélangeant à ce stade pourrait endommager les embouts et causer des fuites. Sous-serrage va aussi conduire à des fuites. </li></ol> Solution de protéines et de lipides Mixage:: Partie 4 Faire la mésophase <ol><li> Pour effectuer le mélange, l&#39;avance du piston sur le côté des protéines de l&#39;unité de mélange assemblés à sa limite, avec le pouce ou l&#39;index de conduite de la solution de protéines de la seringue en protéines, à travers le coupleur et des lipides dans la seringue. </li><li> Le piston du côté des lipides est maintenant utilisé pour piloter le contenu de la seringue de lipides en arrière à travers le coupleur et les protéines dans la seringue. </li><li> Le processus est répété plusieurs fois, parfois, une centaine de passages ou plus sont nécessaires pour produire une mésophase homogène. Au début du mélange, la circulation des matériels avant et en arrière à travers le coupleur peut être inégale et, parfois, une force supplémentaire est nécessaire pour effectuer le mélange. Le mélange initial est généralement accompagnée par le développement d&#39;un trouble non uniforme dans l&#39;échantillon. Comme homogénéisation progresse, la texture devient plus uniforme et caractéristique de la phase visqueuse cubes, tout comme l&#39;aspect visuel de la mésophase émergents cubes. </li><li> Si les conditions sont appropriées et les formes phase cubique, la dispersion devrait apparaître optiquement transparents dans la seringue. Ainsi, les inscriptions sur le corps de la seringue doit être clairement lisible à travers la mésophase dans le canon. </li><li> Refroidissement très légère de l&#39;échantillon durant le mélange en plaçant le mélangeur une seringue pour un court laps de temps sur la glace peut accélérer l&#39;homogénéisation et la réalisation de la transparence. Cependant, il est important de ne pas trop la échantillon. </li><li> Des précautions doivent être prises pour éviter le mélange extrêmement vigoureuse, car cela peut causer température de l&#39;échantillon à augmenter en raison du chauffage par frottement 3. </li></ol> Partie 5: Chargement du distributeur <ol><li> Retirez l&#39;aiguille et le piston d&#39;une seringue de 10 uL de Hamilton. Laisser l&#39;embout téflon en place. </li><li> Retirer l&#39;écrou de retenue du distributeur à l&#39;aide d&#39;une petite pièce de monnaie. </li><li> Avec le bras de cliquet entièrement retirée, insérez la seringue - sans son piston et l&#39;aiguille - à travers l&#39;anneau de maintien du distributeur. </li><li> Remplacer l&#39;écrou de retenue, côté joint face à la seringue, et vissez solidement sur l&#39;extrémité ouverte de la seringue. Des précautions doivent être prises pour assurer la seringue est correctement centré dans l&#39;anneau de maintien et que le baril est aligné parallèlement au bras de cliquet. Les deux peuvent être jugés par les yeux. Ces deux exigences sont essentielles pour éviter les fuites. </li><li> Passe le piston à travers l&#39;anneau de préhension avec l&#39;écrou dévissé pince de quelques tours et guider le piston dans l&#39;extrémité ouverte de la seringue. Appuyez sur le bras de cliquet pleinement. Déplacer le piston dans le cylindre et vérifier qu&#39;il se déplace librement et vrai dans le canon. Elle peut aider à desserrer la vis sur la barre de guide pour faciliter le piston se déplaçant librement. Assurez-vous que c&#39;est le cas. Enfoncer le piston jusqu&#39;à son extrémité téflon s&#39;aligne avec la graduation zéro uL sur le canon. Si la vis sur le guide a été assouplie, elle resserrer et revérifier que le piston se déplace librement. </li><li> Déplacer le piston d&#39;un côté de l&#39;appareil assemblé de mixage à la graduation zéro uL de transférer la mésophase à l&#39;autre seringue et le coupleur. </li><li> Déconnecter la seringue vide (avec son embout en place) de l&#39;unité de mélange et de se connecter immédiatement la seringue chargée - avec le coupleur unettached - à la résiliation filetée de la seringue de 10 uL de distribution. Le degré d&#39;étanchéité avec laquelle couplage est fait est essentiel, comme déjà indiqué. </li><li> Charger la seringue de distribution en appuyant sur le piston de la seringue de 100 uL de sorte que les transferts de mésophase à travers le coupleur. </li><li> Sécuriser un court, à bout plat aiguille pour la terminaison d&#39;acier de la seringue de distribution et serrer soigneusement en place. </li><li> Fixer le piston pour le bras de cliquet en serrant l&#39;écrou dans l&#39;anneau de préhension. Il faut prendre soin de ne pas trop serrer l&#39;écrou, car cela peut marquer et déformer le piston le rendre inutilisable. Il est important que la plage de déplacement fournies au bras de cliquet dans l&#39;état serré se limiter à pas plus d&#39;un pouce, comme l&#39;a montré dans la vidéo. Au-delà de cela, le plongeur aura une tendance à flamber et la livraison peut échouer. </li><li> Appuyez sur le tambour à cliquet à plusieurs reprises pour faire avancer le piston dans le cylindre, comblant ainsi le volume vide de l&#39;aiguille et le chargement de l&#39;aiguille. Cette étape doit être répétée (jusqu&#39;à dix fois), jusqu&#39;à une chaîne continue de la mésophase émerge de la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> Essais de cristallisation doit commencer immédiatement, comme certaines protéines sont instables dans la phase cubique, sans facteur déclenchant ajouté. </li></ol> Partie 6: Mise en place plaques de cristallisation <ol><li> Placer une plaque de cristallisation de plusieurs puits et la lamelle sur une surface surélevée de quelques centimètres au-dessus du banc de travail pour faciliter le chargement. Un contraste optimal et une meilleure visibilité sont obtenus lorsque la surface est légèrement sombre. </li><li> Homogénéiser les solutions précipitant et déboucher le flacon. Régler la pipette précipitants de distribution à 1 pi. </li><li> Avec la seringue de distribution maintenu verticalement dans une main, utilisez la main libre à la position de la pointe de l&#39;aiguille dans le centre et directement au-dessus de la base de plusieurs puits 1. Appuyez sur le bouton sur le distributeur de répéter à expulser un bolus de mésophase sur la surface du verre. Le volume de bolus est de 200 nL lorsque le distributeur standard de répétition est utilisé avec une seringue de 10 mL. La pointe de l&#39;aiguille doit être pas plus de quelques centaines de micromètres au-dessus de la base du puits pour assurer la livraison. </li><li> Après 4 puits adjacents sont chargés avec mésophase, placer 1 ml de solution précipitant sur le dessus de chaque bolus mésophase aide d&#39;une pipette de 2 uL et standard des embouts jetables. </li><li> Aussi rapidement que possible, placer une lamelle carrément sur les puits remplis de les couvrir uniformément. Pour réaliser un joint étanche à l&#39;eau, utiliser une spatule pour appliquer une pression sur la lamelle où il prend contact avec la surface exposée de la bande collante entretoise. </li><li> La mésophase et précipitant processus de distribution peut être répété jusqu&#39;à ce que tous les puits sur la plaque sont chargés et scellés. </li><li> Étiquette de la plaque clairement à des fins de suivi. Sensibles à la lumière des protéines sont généralement traitées en enveloppant les plaques dans du papier aluminium avant de les placer dans la chambre d&#39;incubation. </li><li> Placer les plaques dans une chambre à température contrôlée, habituellement à 20 ° C. </li><li> Sur un horaire régulier, inspecter les puits pour la croissance cristalline en utilisant un microscope à lumière polarisée avec un objectif de 10 ou 20 fois. Le calendrier utilisé dans le laboratoire de l&#39;auteur est comme suit: jour 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 et 60 post-installation. Inspectez soigneusement le bol mésophase ajuster la profondeur de champ dans l&#39;échantillon 0,14 mm d&#39;épaisseur. L&#39;examen doit être fait à la fois à la lumière normale, et entre-croisés des polariseurs. </li></ol> Partie 7: Résultats Représentant L&#39;apparition des cristaux résultants varient avec la couleur intrinsèque de la protéine membranaire, la polarisation de la lumière utilisée pour l&#39;inspection (ou son absence) et la méthode et la qualité de l&#39;éclairage. La figure 6 montre plusieurs apparitions à cristaux possible. Protéines de la membrane colorée naturellement de plus en plus méso lorsqu&#39;on la visionne à la lumière normale peuvent ressembler à ceux de la figure 6 (Panneaux B et D). Cristaux incolores protéine membranaire croissante dans la phase cubique lorsqu&#39;on la visionne à la lumière normale peut ressembler à ceux présentés dans la figure 6 (Groupe E). Enfin, cristaux incolores protéine membranaire de plus en plus méso vus en lumière polarisée peut ressembler à la Figure 6 (panneaux A et C). Les prochaines étapes dans le processus global de détermination de la structure sont à récolter et à la cryo-refroidir les cristaux et d&#39;enregistrer et d&#39;analyser diffraction des rayons X de leur part. Ces sujets doivent être traités dans les articles JoVE séparé. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentation schématique d&#39;une membrane biologique montrant la bicouche lipidique dans et sur ​​lequel sont situés une variété de protéines. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. La structurede la vitamine B 12 protéines, BtuB transport, résolu en utilisant MX et cristaux produits par la méthode de méso 6 illustré dans cet article Jupiter. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Le cycle de structure-fonction illustre plusieurs des étapes impliquées dans l&#39;obtention et l&#39;utilisation de l&#39;information structurale complète au sujet d&#39;une protéine. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. L&#39;organigramme résume les étapes impliquées dans la production de cristaux de protéine de la membrane par la méthode de méso. Seuls les étapes, entourée par la ligne pointillée rouge sont abordés dans cet article Jupiter. De la référence 2. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Un diagramme de phase température simplifiée composition pour le lipide (monooléine) / système d&#39;eau. Essais de cristallisation sont mis en place à 20 ° C où le lipide sature avec de l&#39;eau à hydratation de 40%. Le diagramme de phase détaillée est disponible dans la référence 5. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Cristaux de protéines membranaires croissante dans la mésophase lipidique. (A) la vitamine B 12 des protéines de transport, BtuB 6, (b) collecteurs de lumière complexe II 7, (c) l&#39;OPCA adhésine / invasine 8, (d) 9 bactériorhodopsine, (e) un transporteur de glucides à partir de Pseudomonas. Les images enregistrées avec la lumière normale (b, d, e) et entre polariseurs croisés (A, C).

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	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter,+BtuB,+at+1.95+A+resolution.">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin.">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li></ol>

La phase cubique est un environnement délicat et dynamique qui peut changer radicalement avec l&#39;altération d&#39;un certain nombre de variables. Il n&#39;est pas possible de donner une description de la configuration des essais de cristallisation dans le méso dans le mode manuel qui décrit tous les pièges potentiels. Cependant, de nombreuses difficultés peuvent être évitées par la pratique de la technique avant de l&#39;appliquer à des solutions coûteuses et de protéines en utilisant la modération de la pression appliquée à des seringues durant le mélange. Fait correctement, la méthode de méso peut produire des cristaux d&#39;une grande variété de protéines, dont le nombre est en constante augmentation. La description donnée ici de la configuration des essais de cristallisation dans le méso est axé sur le mode manuel. Le processus peut être et est souvent modifié pour faciliter la configuration automatisée des plaques de cristallisation dans les cas qui requièrent dépistage à grande échelle des conditions de cristallisation.

* Détails pour l&#39;usinage complet de votre propre coupleur alésage étroit sont fournis dans la référence 3.

crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases

Un protocole détaillé pour la cristallisation des protéines membranaires en utilisant mésophases lipidique est décrite. Cette méthode a été diversement appelée la phase lipidique cubique ou dans la méthode de méso. La méthode a été montré pour être très polyvalent en ce sens qu&#39;elle a été utilisée pour résoudre rayons X des structures cristallographiques des protéines procaryotes et eucaryotes, les protéines qui sont monomériques, homo-et hétéro-multimériques, chromophore contenant et le chromophore-libre, et l&#39;alpha hélice et le bêta-tonneau protéines. Les récents succès en utilisant la cristallisation méso sont les humains conçus bêta2-adrénergiques et adénosine A2A G récepteurs couplés aux protéines. Les protocoles sont présentés pour la reconstitution de la protéine membranaire dans la mésophase monooléine basée, et pour la mise en place des cristallisations dans le mode manuel. Des étapes supplémentaires dans le processus global, comme la récolte de cristal, doivent être abordés dans les articles vidéos avenir. Le temps nécessaire pour préparer la mésophase protéines chargées et de mettre en place une plaque de cristallisation est manuellement environ une heure.

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Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Ici est décrit la procédure de mise en œuvre dans le Groupe Membrane Biology Caffrey structurale et fonctionnelle de mettre en place manuellement des essais de cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

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29.8K vues.  Trinity College Dublin. Ici est décrit la procédure de mise en œuvre dans le Groupe Membrane Biology Caffrey structurale et fonctionnelle de mettre en place manuellement des essais de cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique.

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The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importance de la concentration de protéines correct pour Cinétique et Détermination d&#39;affinité en analyse structure-fonction

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Recherche

Biologie

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume Bio-spec Spectrophotomètre Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Suivi cellule à l&#39;aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

ARN prédiction de la structure secondaire via SHAPE à haut débit

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...