レーザー走査型共焦点顕微鏡の電源を入れ、スライドホルダーにスライドを置きます。画像の視覚化と取得には、20倍の対物レンズを選択します。共焦点ソフトウェアからシーケンシャルスキャンモードを選択して、BODIPY 493/503とDAPI間のクロストークを回避します。
次に、488ナノメートルのアルゴンレーザーラインを使用してBODIPY 493/503ダイを励起し、405ナノメートルのレーザーラインを使用してDAPI染色を励起します。発光範囲を、BODIPYの場合は493〜589ナノメートル、DAPIの場合は410〜464ナノメートルに設定します。次に、フレームサイズ、スキャン速度、平均化(ビット深度の2倍を12ビット、方向を双方向、スキャンエリアデジタルズームマイナス1、ピンホールマイナス1エリア単位)を調整して顕微鏡設定を行います。
ゲインとデジタルゲインの設定を調整します。範囲インジケーターで示される飽和ピクセルがないことを確認します。脂肪滴を正確に識別した後、BODIPYおよびDAPIチャネルで画像を取得します。
広域画像を作成するには、10倍の主観レンズに切り替えます。次に、タイルスキャンモードをアクティブにし、5 x 5のモザイク画像を生成するように構成します。3Dおよび直交ビューを生成するには、カバーガラスの上部に液浸オイルを滴下し、対物レンズを40倍レンズに変更します。
Z スタック モードを選択します。Z平面を調整して画像キャプチャの最初と最後の位置を定義し、焦点が合っているすべての液滴をキャプチャするために約0.5ミクロンの光学スライスの厚さを確保します。直交ビューを選択し、直交ビューを作成します。
透明レンダリングモードに続いて3Dモジュールを選択して、3D画像を取得します。画像取得後、セルプロファイラを使用して単一平面画像の処理と分析を開始します。CellProfilerインターフェイスの左上隅にある画像モードをクリックして、TIF形式で画像をアップロードします。
ファイル名に基づいてBODIPY液滴とDAPI核染色画像をソートするには、名前とタイプモジュールを使用します。脂肪滴分析には、BODIPY染色画像のみを使用してください。[モジュールの調整]をクリックしてパイプラインの構築を開始し、色からグレーへのモジュールを選択して画像をグレースケールに変換します。
次に、一次物体の識別モジュールを使用して、6〜300ピクセルの間の脂肪滴と1の閾値補正係数を定義して、グレースケール画像内の脂肪滴を検出します。識別された脂肪滴のピクセル強度を測定するには、測定オブジェクト強度モジュールを追加します。追加のフィルターオブジェクトモジュールを組み込んで、最も強いシグナルのみが定量化され、強度の低いシグナルが最終的な脂肪滴分析から除外されるようにします。
次に、出力データに関連する脂肪滴を測定するために、物体サイズ形状測定モジュールを追加する。次に、オーバーレイアウトラインモジュールを追加して、識別された液滴を元の画像にオーバーレイし、未処理の画像でもセグメンテーションが正確に見えるようにします。完了したら、スプレッドシートモジュールへのエクスポートを追加し、左下隅にある[画像の分析]ボタンをクリックします。
対照と比較して、HFDを与えられた動物は、顕著な脂質異常プロファイルおよび循環トリグリセリドレベルの微妙な増加を示した。広域画像は、HFDを与えられた動物の肝臓全体で脂質液滴の増加を明らかにした。CellProfilerによる分析により、肝脂肪滴数の増加、BODIPY蛍光強度の増加、360%面積比、およびより大きな直径が明らかになりました。
HFDを与えられた動物におけるサイズ分布は、9ミクロン以上のマクロ小胞性肝脂肪滴の増加と3ミクロン未満の微小小胞の減少を明らかにした。
