Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (HiPSCs)

まず、培養線維芽細胞のフラスコを取り、hiPS細胞培養に適した10cmの細胞培養プレートに1プレートあたり4ミリリットルのコールドコーティング液をコーティングし、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。その後、線維芽細胞から培地を取り出し、フラスコあたり4ミリリットルの予熱PBSで洗浄します。PBSを吸引し、摂氏37度で5〜7分間インキュベートすることにより、線維芽細胞をフラスコあたり4ミリリットルのトリプシン-EDTAと関連付けます。

位相差顕微鏡を使用して細胞の剥離を監視し、必要に応じてフラスコの側面を軽くたたいて、プラスチック表面から細胞を剥離します。剥離した細胞を50ミリリットルの円錐管に移し、6ミリリットルの予め温めた線維芽細胞培地で空のフラスコを洗浄する。円錐管に残りのセルを集めてプールします。

次に、細胞を200 gで摂氏20度で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを3ミリリットルの新鮮な予熱PBSに再懸濁します。細胞を数え、10の1.5倍から6番目の線維芽細胞を新しい円錐管に移し、5ミリメートルのマークまでPBSで満たします。

チューブを200gで摂氏20度で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルのエレクトロポレーション培地に再懸濁し、再度遠心分離する。その間に、コーティングした10センチの細胞培養プレートからコーティング液を吸引し、あらかじめ温めた線維芽細胞培地を7ミリリットル加えます。

遠心分離の最後に、上清を捨て、細胞ペレットを250マイクロリットルの10〜6番目の細胞に1.5倍の濃度のエレクトロポレーション培地に再懸濁する。250マイクロリットルのセル懸濁液を、ギャップ距離が4ミリメートルのエレクトロポレーションキュベットに移します。次に、各プラスミドを総容量50マイクロリットルのエレクトロポレーション培地に4マイクログラム添加することにより、血漿トランスフェクションミックスを調製します。

トランスフェクションミックスをキュベットに移し、フリックして穏やかに混合し、280ボルトで1パルスでエレクトロポレーションします。最後に、作製した10cmの細胞培養プレートに150マイクロリットルのエレクトロポレーション線維芽細胞を移す。プレートを全方向に3回攪拌して細胞を分配し、一晩インキュベートします。

線維芽細胞は、150〜300ナノメートルのサイズの長い紡錘状の表現型で存在する。再プログラミング後、50マイクロメートルの小さなhiPS細胞を持つコロニーが発生し、明確な境界が表示されます。hiPS細胞は、高い核対体比と増加した増殖率によって区別されます。