はじめに、2ミリリットルの4%ホルマリンまたは他の適切な固定剤を準備します。また、手順を開始する前に、シャーレ、鉗子、外科用ハサミを準備しておいてください。適切に安楽死させた凍結損傷した魚を、脱イオン水を含むシャーレに入れます。
はさみを使用して、尾柄の前後に体を切る。シャーレ内の脱イオン水で組織を出血させます。鉗子を使用して、尾柄を収集し、マイクロ遠心チューブ内の準備された固定液に移します。
チューブを数回慎重に反転させます。取り付ける前に、固定した組織をPBSでロッカーで10分間洗浄します。次に、脱イオン水中の30%スクロースの溶液を含む2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、摂氏4度に予冷し、チューブを数回静かに反転させます。
チューブを摂氏4度で少なくとも24時間直立させたままにします。埋め込み型に5ミリメートルのOCT封入媒体を充填します。鉗子を使用して、尾柄を型の底に置きます。
横断セクションまたは冠状セクションの向きを調整します。ドライアイスの箱で培地を凍らせます。組織が希望の位置に安定したらすぐに、OCTが完全に凍結する前に金型の残りの部分を充填します。
クライオスタットを使用して組織を切片化する前に、金型を摂氏80度で少なくとも1時間保管します。凍結損傷後の異なる日における凍結損傷の程度(DPCI)は、アニリンブルー、アシッドフッチン、およびオレンジ-Gで構成されるトリクローム染色を使用して尾柄切片で分析されました。損傷領域は、オレンジ色の染色がないことによって決定されました。
4および7 dpciでは、横断面は体の凍結損傷した側面に広範囲に変性した骨格筋を示しました。免疫蛍光分析では、4 DPCIでは、尾柄の損傷側には豊富なDAPI陽性細胞が含まれていましたが、F-アクチンとトロポミオシン1はほとんどまたはまったく含まれておらず、筋肉の変性を示しています。7 dpciでは、トロポミオシン1とF-アクチンが創傷で検出され、垂直体の正中線に近く、新しい筋線維形成の開始を示しています。
30 dpciでは、体の両側で同様のF-アクチン染色の分布を示し、効率的な骨格筋修復を示しました。
