私たちは、批判的な読みとコメントを提供してサラディックに感謝したいと思います。 MARは、分子遺伝学のカナダリサーチチェアを保持し、ハワード·ヒューズ医学研究所の国際研究学者である。この作品は、米国国立衛生研究所（NIH）、ハワード·ヒューズ医学研究所、カナダ衛生研究所、筋ジストロフィー協会とカナダリサーチチェアプログラムからMARへの補助金によって支えられている。

全ての実験は、動物のケアと処理のための規制のオタワ大学によると取り扱われていました。 プロトコルの概要については表1を参照してください。 1。アイソレーションを開始する前に<ol><li>次の解決策を準備します。 0.2％コラゲナーゼタイプDMEM中で私（ダルベッコ改変イーグル培地、110 mg / mlのピ​​ルビン酸ナトリウムによる高グルコース、L-グルタミン）。については、2つのEDL筋肉はDMEM中で0.2％Collagenease 2mlの準備をします。 0.22μmフィルターを通して溶液をフィルタリングします。 37℃prewarm分離の10分前、℃の水浴インチ原液コラゲナーゼの追加のアリコートを、後で使用するために-20℃で凍結することができます。 注：この手順のすべてを通してピルビン酸ナトリウムを含むDMEMを使用しています。繊維は、ピルビン酸ナトリウムを含まない培地では存続しません。 <ul><li>洗濯メディア（すべての洗浄を行うために使用します）。 1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを補足するものです。 0を介してフィルタリング使用前にフィルター0.22μmである。 </li><li>筋線維培地。 20％FBS、1％ニワトリ胚エキス及び1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを補足するものです。使用前に0.22μmのフィルターでろ過。 </li><li>コー​​ティングされた料理をマトリゲル。時間の長い期間のための培養繊維に、我々は、コーティング基材としてマトリゲルの使用をお勧めします。マトリゲルコートディッシュを準備するには、4℃で一晩マトリゲルのアリコートを解凍します。一日を過ごした後、DMEM中マトリゲル1:10に希釈します。すべての回で4℃でCをマトリゲルを維持し、これは塗布ムラが生じるマトリゲルソリューション内で微細な結晶を作成するので、急激な温度変化を避けてください。氷の上にコーティングされる皿を置きます。表面を覆うだけで十分なボリュームでコートディッシュ。それは1分間座ってみましょう。完全に残ったマトリゲルを削除します。使用前に、または一晩少なくとも3時間37℃で食器乾燥させます。 </li></ul> 注：4＆ドで保存した場合、希薄化後のマトリゲルのアリコートは、コーティングの目的のために複数回再使用することができますグラム、C. </li><li>最後に、70％エタノールを用いて顕微鏡ステーションと解剖ツールを清掃してください。 </li><li> 2 EDLのアイソレーションは、（1マウス）は、次のように5プラスチック製ペトリ皿を（60 * 15ミリメートル）の準備のために： <ul><li>分離のための四つの皿（筋解離のための1、シリアル洗浄のための3）。すべての料理は、プラスチックに付着する筋繊維を防ぐために馬血清（HS）でコーティングされている必要があります。コー​​ト、それぞれの皿にウマ血清のピペット3ミリリットル、均一なコーティングを可能にするスワールに、馬の血清を除去し、少なくとも30分間皿は乾燥させてください。各皿にDMEMの4ミリリットルを追加します。使用に先立って、5％CO 2インキュベーター内で37℃で料理をしてください。 </li></ul> 注意：滅菌守れば馬の血清を、複数回再使用することができます。あるいは、DMEM中10％HSの溶液がコートディッシュに使用することができます。全体のプロトコルを通して、HSコートディッシュを使用して、浮動小数点の条件で培養するとき筋線維。 <ul><li>一皿は、分離後の培養線維に使用されます。 Altキーernative皿のサイズやフォーマットは、下流のアプリケーションに応じて、筋繊維の最終培養に使用することができます。しかし、我々は、60 * 15ミリメートルより大きい皿の大きさを示唆していない。ハイパー収縮が発生する前に、筋線維は、もはやより96時間懸濁状態に維持することができます。長い培養時間のために、私たちはマトリゲル被覆皿やプレートの使用をお勧めします。 </li></ul></li><li>筋肉処理および筋線維操作のための1小口径ピペット用の大口径ピペット：1繊維の分離（2 EDL）は、2つの滅菌パスツールピペットを準備します。ピペットのエッジを滑らかにするために、所望の長さと熱ポリッシュに各ガラスピペットを切断するためにダイヤモンドペンを使用しています。炎を使用することにより、小口径ピペットの先端カーブ。これは、単繊維を処理するのに役立ちます。火炎滅菌する。使用前にHSとコートが各ピペット。 </li></ol> 2。筋肉の解剖と消化<ol><li> Rosa26TdTomato（;これらの実験の目的は、8週齢のSV129、Pax7クレエCklr用Pax7Cre-TdTomato）およびMyf5-CRE; Rosa26YFPを使用した。 </li><li> 70％エタノールで後肢を吹き付けます。手順の実行中に後肢のより良い理解を持っているために、支持基板に動物（顔アップ）ピン。 </li><li>はさみの助けを借りて、四肢の全体の長さを切って、基礎となる筋肉を公開します。皮膚だけでなく、任意の髪の毛や毛皮（ 図1A）を取り外します。 </li><li>細かいはさみと、下層にある筋肉を損傷することなく、薄い筋膜を介してカット。視覚的にEDLをローカライズします。 EDLはちょうど前脛骨筋（TA）の筋肉の下に後肢の前方コンパートメントに含まれています。 </li><li> 2鉗子の助けを借りて、遠位腱を公開します。 </li><li>鋭いCohann-Vannas春ハサミで遠位腱（TAとEDL両方の）カット。 </li><li>鉗子の助けを借りて、彼らの腱によって、TAとEDL筋肉の両方を保持し、微妙に近位端に向かって筋肉を引き上げます。この時点では、はっきりと見ることができるはずですただTAの筋肉の下にEDL筋肉。さて、反対方向（ 図1B）の2つの腱を引っ張ることにより、TA筋からEDLを区切ります。これが筋繊維を傷めますので、この操作を実行中にEDL筋肉をストレッチングは避けてください。 </li><li> EDLの腱を公開します。より良い近位腱を視覚化するためには、TA筋肉を削除するには、この点で助けるかもしれない。また、膝の周りにいくつかの結合組織（ 図1C）を遮断するのに役立つことがあります。 </li><li>近位腱を切って、優しく、EDL（ 図1D）を取り外します。 </li><li>その腱、筋肉を保持することによって、先に調製したコラゲナーゼ溶液2mlに転送します。水浴中で37℃でインキュベートする。 注：正常な繊維の分離のために、それは筋線維の整合性が維持されるように腱から腱にEDLを分離することが重要です。 2.3から2.9までの手順が解剖顕微鏡下で行うことができる。あるいは、MAGNの使用ガラスをifyingことも筋肉の方のビューを持っているのを助けるかもしれません。 </li><li>第二EDLを分離するために2.3から2.9の手順を繰り返します。同じチューブ内の第二のEDLを転送します。でこぼこの消化を避けるために、第二のEDLの単離は、わずか5分後の最初に完了する必要があります。 注1：インキュベーション時間は、コラゲナーゼ活性に応じて調整する必要があるかもしれません。長くしたり短くインキュベーションは、サイズ、年齢および/ ​​または筋肉の状態（ 例えば、線維筋肉は長い消化時間を必要とする）に応じて必要となる場合があります。 注2：筋肉消化時に休止状態、攪拌下、衛星細胞の挙動を調べる場合は衛星細胞10を活性化することができる。 </li><li>消化時間の間、定期的に過剰消化を回避するために、筋肉を確認してください。筋肉がほぐれ始め、筋繊維が表示されているときに消化を停止します。消化を停止するには、慎重にしたDMEM（dissociati 4mlで温めておいたシャーレに、両方の筋肉を転送皿の上）。この操作を実行するには、大口径のピペットを使用しています。 注：Hyper委託筋繊維の分離では、この必然的結果として筋肉の過剰消化を避ける。 </li></ol> 3。単一筋線維解離と文化<ol><li>筋繊維を解除するには、繊維が自然に放出され始めるまで、暖かい培地で筋肉をフラッシュするために大口径ガラスピペットを使用しています。これは必然的に有害な繊維が発生するので、筋をひいて粉にするしないでください。解剖顕微鏡下でこれと次の手順を実行します。 </li><li>希望数に達するまで、筋繊維を放出続ける。皿を10分以上室温で必要とされる場合37℃で5 min（最小）インキュベーション℃、5％CO 2の媒体を再平衡化するが可能になります。 注：メディアは長時間生理以下の温度（37℃）に達した場合筋繊維は死んでしまう。 </li><li>小型ボアピペット、transfe使い方rが新しいあらかじめ温めておいた皿（3つの連続した​​洗浄の最初）に単一筋繊維を生きる。すべてを一度に筋繊維のバルクを転送する代わりに、個々にそれぞれの筋線維を処理します。必要に応じて、37℃で、培地を再平衡化するために10〜15分間、5％のCO 2。 </li><li> 2回以上またはすべての死んだ筋繊維や破片が削除されるまで、ステップ3.3を繰り返します。我々は、適切なクリーンアップのために、少なくとも3つの連続洗浄をお勧めします。 注意：ショートとハイパーは、顕微鏡の光の下で契約通りに死んだ筋繊維が表示されます。 </li><li> 37℃単一筋繊維をインキュベート℃、前培養培地への切り替えには、少なくとも1時間、最後の洗浄の皿（のみDMEM）中で5％のCO 2。これは、筋繊維が血清の非存在下でin vitroでの条件に調整することができます。我々は血清富栄養培地繊維の縮小を増加に筋繊維の即時文化を発見した。 </li><li> 1時間後、新たな温めた皿にするか、適切なカルチャ形式に筋繊維を転送下流のアプリケーションに応じて。高血清培地で培養繊維は衛星細胞の活性化を可能にします。あるいは、血清またはニワトリ胚抽出物の異なる濃度を使用することもできます。一日おきに培地を変更します。 </li></ol> 4。下流アプリケーション<ol><li> 免疫染色 。ライブ筋繊維を単離中に固定されており、任意の時点で染色することができる。免疫は、フローティングと基板に接続された筋線維の両方で実行することができます。フローティング筋繊維を染色した場合、別の溶液から筋繊維を転送するために小口径のガラスピペットを使用しています。あるいはまた、それはすべての手続きを通して同じ井戸に筋繊維を維持し、ガラスピペットを使用してソリューションを追加/削除することが可能である。これは同様に筋線維の除去になりますように、標準の吸引を避ける。簡単に言えば、完全に培地を除去し、5分間温めておいた4％パラホルムアルデヒド（PFA）でフィックス筋繊維。 PBSで数回洗浄する。インキュベーションPFAのバックグラウンド染色を最小限に抑えるために、PBS中1％グリシンまたは他の標準的な焼入れソリューションのTE筋繊維。必要に応じて、PBSで5分間洗浄続く10分間PBSにTriton X-100を0.1％筋繊維を透過。室温で1時間以上、好ましくは一晩4℃でのブロッキング溶液中で繊維（10％ウマ血清、0.1％トリトンX-100、1％NaN）をインキュベート代替ブロッキング溶液は、目的の抗体に応じて、使用されるかもしれません。 5分間PBSで一度洗浄します。 4℃、室温で1時間または一晩ブロッキング溶液で希釈した適切な一次抗体とインキュベート任意の未結合抗体を除去するためにPBSで洗浄あたり5分で繊維を3回洗浄します。室温で45分〜1時間のための適切な二次抗体を用いてインキュベートします。 PBS中で洗浄あたり5分で3回洗浄する。 1 mg / mlのDAPIで核を対比染色する。浮遊繊維を染色した場合、顕微鏡に適したガラススライドに各繊維を転送します。 PBSまたは媒体の任意の過剰を削除します。メディ取付適用ええと、その後カバースリップを追加します。蛍光顕微鏡下で筋線維を可視化するために進んでください。 EDLの筋繊維に代表免疫については、 図4を参照してください。強力な固定剤を使用する代替染色手順はVermaさん、M. ら 11 Wosniak、交流ら 12に記載されている。 </li><li> オリゴヌクレオチドまたはプラスミド一過性トランスフェクション 。ライブ筋繊維は、関心のある特定の遺伝子/ sのプラスミドまたはsiRNAをトランスフェクトすることができます。 siRNAを使用する場合は、二重トランスフェクションは、効率的な遺伝子ノックダウンすることをお勧めします。我々は、分離から8時間後の最初のトランスフェクションを行うことをお勧めします。トランスフェクション後の六時間は、新鮮な培地と交換してください。 siRNAトランスフェクションのために、私たちは、50nMの最終濃度を使用して開始を示唆している。遺伝子発現のノックダウンは、RNA抽出によって、または好ましくは免疫染色によって分析することができます。 </li><li> ウイルス感染 。ライブ筋繊維の感染は可能ですが、ここではセルの発生率死はオリゴフェクションに比べて高く、感染効率は、筋肉の状態や年齢に応じて可変とすることができる。例えば、そのまま大人になってから筋肉の筋線維は、宿主感染13,14に対する保護バリアを提供することが示されている基底膜が存在するために、ウイルス感染に特に非応答性である。彼らは静止（非有糸分裂）細胞に感染することができますので、レンチウイルスベクターはレトロウイルスベクターよりも優先されます。ウイルス感染の場合は、マトリゲル被覆された皿やプレート上で培養繊維へのお勧めで、筋繊維が最初の24時間のためのメディアの状態に調整することができます。 </li><li> イメージングを生きる 。筋繊維のイメージングは特に時間がかかり、37℃、5％CO 2のチャンバーを備えた顕微鏡を必要と住んでいます。単一のサテライト細胞の挙動を評価する際に便利です。この技術を用いて行われた作業は、衛星細胞の異質性の発見のために尽力されているとそのbehaを勉強する繊維上vior（15と16）。 </li></ol>

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無競合する利益はありません。

無傷の筋肉からの単一筋線維の単離および培養は、筋肉の再生の過程を研究するためのin vitroでの優れたモデルを提供します。このシステムのユニークな特徴は、基底膜の下に、それらの生理学的環境での衛星細胞の保存です。最も重要なのは、技術は、静穏と活性化状態の両方で筋幹細胞の挙動を調査するために使用することができます。過去20年間、筋線維培養系は、内因性および外因性の決定要因の両方に関して衛星細胞集団の生物に有意義な洞察を提供してきました。培養個々の筋線維、筋原線維に対する衛星細胞の不均一性により、筋肉のタイプや再生能力は15対処されています。衛星細胞遊走パターン16上の獲得については、許可された単一の培養繊維のライブイメージングを用いた研究を練る。定量的なデータの取得がある可能LSO。時間がかかるが、それは特定のイベント（幹細胞の非対称分裂、増殖および分化比等）の分布と発生に関する重要な情報を提供します。 FACSまたは他の手段による衛星細胞の純粋な集団の単離は、分子レベルでのタンパク質または遺伝子発現の変化を調査するための優れたプラットフォームを提供するかもしれませんが、一緒に前に説明したアプリケーションと、単繊維からタンパク質またはRNA抽出も可能である。我々の経験では、成功した繊維の分離のための最も重要なステップは、アイソレーション（2.5から2.9プロトコル·テキスト内のステップ） &quot;腱の腱&quot;です。これは、筋肉消化後、繊維はこのように、最小の、または全然ダメージは以下の手順で自分のパフォーマンスを向上させると共にEDLから解放されることを保証します。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬/素材 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C0130-1G </td><td>最適な結果を得るために新鮮なすべての回を準備します。原液コラゲナーゼの追加のアリコートを-20℃で保存することができます</td></tr><tr><td> DMEM高グルコース+ NaPyr </td><td>インビトロジェン</td><td> 11995073 </td><td>ペニシリン/ストレプトマイシンを添加すると、空気の混入を最小限に抑えることが必要である</td></tr><tr><td>特徴ウシ胎児血清</td><td> Hyclone社</td><td> SH30396.03 </td><td>ロット＃KUJ35152 </td></tr><tr><td>ウマ血清</td><td> Hyclone社</td><td> SH300.74.03 </td><td>ロット＃AVJ82494 </td></tr><tr><td>ニワトリ胚エキス</td><td>正確な化学</td><td> CE-650-T、バッチB7035010 </td><td>凍結融解の繰り返しは避けてください。 </td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td> BD </td><td></td><td> -20℃で保存するアリコート凍結融解の繰り返しは避けてください。 4℃で希釈アリコートを保存</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas春シザーブレード - ストレートシャープ6ミリメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15000から02 </td><td></td></tr><tr><td>エキストラシンアイリスはさみ-10.5センチメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14088から10 </td><td></td></tr><tr><td>カーブモリアアイリス鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11373から12 </td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td>ダイヤモンドペン</td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15ミリメートルペトリ皿</td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td>アクロディスク0.22μmのフィルター</TD&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145から477 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡StemiV6を解剖する</td><td>ツァイス</td><td></td><td>追加の光源が良いフォーカスビューを持つことが必要になることがあります</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

成人の筋肉の再生には、衛星細胞と呼ばれる幹細胞を常駐することによって行われる。衛星細胞は基底膜と各筋線維の筋鞘の間に自分の位置によって定義されます。彼らの行動の現在の知識が大きく、単一筋線維の単離プロトコルの使用に依存している。 1985年には、ビショフは、筋線維とその幹細胞との間の物理的な関連付けが1保存されているin vitro系を作成することを目標に成体ラットの短趾屈筋（FDB）から単一のライブ繊維を分離するためにプロトコルについて説明しました。 1995年には、筋繊維が単独でピックアップし、コラゲナーゼ消化後に別に処理の代わりに重力沈降2,3によって隔離されていることなどビショフプロトコルをRosenblattmodified。ローゼンブラットまたはビショフプロトコルは以来、異なる筋肉、年齢や条件3-6に適応されています。単一筋線維の分離技術が不可欠であるそのユニークな利点による工具。まず、単一筋線維プロトコルでは、衛星細胞は、基底膜の下に維持されています。このような蛍光活性化細胞選別のような他の技術は、化学的、機械的組織解離7を必要とするため、これはプロトコルのユニークな機能です。筋線維培養システムはin vivo試験での代用はできませんが、それは筋幹細胞の関連する生物学的特性に対処するための優れたプラットフォームを提供していません。単一筋繊維は、標準的なめっき条件や浮遊条件で培養することができる。フローティング筋繊維のサテライト細胞が筋線維環境以外ほとんどない他の影響にさらされる。基板剛性とコーティングが筋肉8,9を再生成するために、衛星細胞の能力に影響を及ぼすことが示されているので、これらの要因のそれぞれを制御できることは、独立してニッチ依存性および非依存性応答の間の区別を可能にします。血清の異なる濃度は持っているまた、休止からのアクティベーションへの移行に影響を及ぼすことが示されて。それに関連付けられた衛 ​​星細胞の休止状態を維持するために、繊維は1-3低血清培地中で保たれるべきである。休止状態に関与する遺伝子を研究する場合に特に便利です。血清富栄養培地では、衛星細胞は急速にこうして生体再生プロセス1-3 の模倣、移行と差別化、有効化、増殖する。システムは、化学阻害剤のテストなどの種々のアッセイを実行するために使用することができ、ウイルスの配信による遺伝子の異所性発現は、オリゴヌクレオチドによる遺伝子ノックダウンやライブイメージング。この動画の記事は現在、成体マウス（6-8週齢）の長趾伸筋（EDL）筋肉から単一筋繊維を単離するために、我々の研究室で使用されるプロトコルについて説明します。

ここでは、成体マウスのEDL筋肉から単一筋線維の単離を説明。成功した筋線維の収量は、コラゲナーゼ活性や筋肉の状態や年齢など、いくつかの要因に依存します。最も重要なのは、腱からEDL筋肉から長い間、無傷の筋繊維の腱結果に筋肉の分離図1は、分離&quot;腱の腱&quot;のステップバイステップのグラフィカルな表現を示しています。筋肉が完全に消化されると、筋線維が筋肉に穏やかな圧力を適用することによって解放されます。 図2Aは最初の洗浄後の筋線維の分離実験の代表的な写真を示す。この時点で、文化が長くて輝く管状構造として表示され、単一筋繊維の束の混合物を含む、ハイパーは、消化過程から暗くて短いと破片アール筋繊維を契約。少なくとも3つの連続した​​洗浄の終わりまでには、唯一つのライブ筋繊維は、ジに残るべき文化または下流の分析はsh（ 図2B）。図2Cは、ハイパー委託繊維（C &#39;）に比べて長く、ライブ繊維を示しています。分離の時点では、衛星細胞が筋線維表面（ 図3A）の小さな突起として表示されます。血清富栄養培地中で維持した場合、衛星細胞は、活性化増殖し、移行し最終的には筋管（B）に融合する。文化の中で15日後に、すべての筋管は、成人における筋肉の再生は、その開発中のある時点で筋原性決定因子Myf5を表明していたことが細胞によって行われることを示唆しているMyf5レポーターYFP（C）を表現しています。すべてのサテライト細胞が対になったボックス型転写因子Pax7 17を表現しています 。レポーターマウスラインPax7Cre-TdTomatoは TdTomato蛍光シグナル（ 図3D及びE）の発現を介して衛星細胞を追跡するために使用することができます。 図4に示す代表的な免疫ダブルPax7 + / MyoDの衛星細胞のnofluorescence。古典的には二重Pax7 + / + MyoDの衛星細胞はどちらダウンMyoDのを規制するとPax7表現18を維持することによって、MyoDの発現または休止へのリターンを維持しながらダウンPax7を調節することにより、分化プログラムを完成させ増殖コミット筋肉前駆細胞と考えられている<img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。マウス後肢からEDL筋肉分離。 8週齢の成体マウスの。後肢。矢印は遠（ひざ）と近位腱（足）腱を示しています。Bは 。前脛骨筋（TA）の筋肉と長趾伸筋（EDL）の筋肉の解剖学的位置するc。近位腱を通してEDLを保持することによって、筋肉を遠位腱を露出するために膝に向かって引っ張られています。Dが 。遠位腱であるカットとEDLが解除されます。 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。単一筋線維の分離実験の代表的な結果。最初の洗浄工程における筋線維の分離実験。明視野像。赤い矢印はライブ筋繊維を示し、白い矢印は、ハイパー委託筋繊維を示し、黄色の矢印は、細胞、筋線維やECMの残骸を示しています。Bは 。 DMEM中で連続した回洗浄した後、唯一のライブ筋繊維が残っています。CとC &#39;。画像は、長い無傷ライブ筋線維（C）および筋線維を（C &#39;）を契約した短いハイパーを表しています。バーは10μm。写真はAxioCam HR装備ツァイスアクシオオブザーバーZ1顕微鏡で撮影した。 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="図3"/> Figur<html> E 3。単一筋線維培養実験の代表的な結果。右の単離後、その関連衛星細胞（矢印）（時間0）になります。Bとシングル、ライブ筋線維の。明視野像。単一筋繊維をマトリゲル上に播種し、15日間血清豊富な培地で培養した。単一細胞（黄色の矢印）は、Cに比べて、白矢印は、分化した筋管を示しています。 Myf5Creから単一筋線維; RosaYFPマウスは 、Bのように培養した。矢印はMyf5派生筋管を示しています。DとE。 Pax7Creから単一筋繊維; TdTomatoを単離して、右後に修正されました。矢印はPax7正静止衛星細胞（E、赤）を示す。核はDAPI（D）で対比染色した。バー：50μmである。写真はAxioCam HR装備ツァイスアクシオオブザーバーZ1顕微鏡で撮影した。 方法 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。筋線維上の衛星細胞の免疫蛍光染色の例。単一筋繊維を単離し、フローティング条件で72時間培養した。筋繊維のサテライト細胞は衛星細胞特異的マーカーPax7（B、赤）と筋原性調節因子MyoDの（C、緑）で染色した。核はDAPI（A）で対比染色した。バー：50μmである。写真はAxioCam HR装備ツァイスアクシオオブザーバーZ1顕微鏡で撮影した。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 筋肉解剖 （5分毎に筋肉） </td><td><ul><li>腱分離に腱</li><li>シャープツール</li><li>最小限の筋損傷</li></ul></td></tr><tr><td> 筋肉消化 （30-45分） </td><td><ul><li>温度敏感</li><li>過剰消化を避ける</li></ul></td></tr><tr><td> 繊維の分離 </td><td><ul><li>繊維の操作をする上で避ける</li><li>数回の洗浄でデブリを除去する</li></ul></td></tr><tr><td> 繊維·カルチャー （最大3〜4週間まで） </td><td><ul><li>フォーマット：任意</li><li>コー​​ティング：ウマ血清、マトリゲル</li><li>媒体：基礎または血清高</li></ul></td></tr></tbody></table> 表1。筋線維の単離プロトコルの概要。筋線維分離プロトコルは4つの主要なステップで構成されます。ステップごとに、おおよその時間や主要臨界点が議論されています。各ステップの詳細については、プロトコル·テキストを参照してください。

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Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである<em&gt; in vitroで</em静穏化、活性化と分化を通じて衛星細胞の転移を研究する&gt;システム。重要なのは、単一筋線維培養系は、筋幹細胞ニッチの不可欠な構成要素である筋原線維/幹細胞の関連付けを維持します。

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

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Research

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Biology

62.1K ビュー.  Ottawa Hospital Research Institute. 筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである in vitroでシステム。重要なのは、単一筋線維培養系は、筋幹細胞ニッチの不可欠な構成要素である筋原線維/幹細胞の関連付けを維持します。

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Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

生物学

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

骨格筋からのミトコンドリア単離

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...