7〜8週齢の安楽死させたオスのマウスをクリーンベンチの表面に置くことから始めます。マウスの腹部皮膚を下腹部に向かってハサミで切る。太ももの内側から脂肪組織を切除します。
切除した組織を、FBSまたは抗生物質を含まない酵素D、R、Aの酵素混合物2.5ミリリットルとDMEM/F12222の2.35ミリリットルを含む氷上のチューブCに入れます。はさみを使用して、脂肪組織を約2平方ミリメートルのサイズに切ります。チューブCのキャップをしっかりと閉じ、チューブを反転させます。
チューブを組織解離器のスリーブに取り付け、サンプルを摂氏37度で40分間消化します。次に、FBSと抗生物質を含むDMEM/F12培地を摂氏37度に予熱します。インキュベーション後、チューブCを組織解離器から取り外し、FBSと抗生物質を含む5ミリリットルのDMEM/F12を加えて消化を停止します。
静かにピペットで4回。懸濁液を700gで摂氏20度で10分間遠心分離する。細胞パレットを乱すことなく、上清を注意深く吸引する。
FBSと抗生物質を含む10ミリリットルのDMEM/F12にペレットを再懸濁し、5回穏やかにピペットで固定します。50ミリリットルのチューブ上に置かれた直径70ミクロンのセルストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過します。ろ液を250gで5分間遠心分離する。
ペレットを10ミリリットルのPBSに再懸濁します。プレーティングする前に、細胞懸濁液を500gで5分間遠心分離します。上澄み液を捨てる。
FBSと抗生物質を含む10ミリリットルのDMEM/F12にペレットを再懸濁します。懸濁液を穏やかにピペッティングして10回混合する。10ミリリットルの懸濁液を10センチメートルのコラーゲンコーティング皿にプレートします。
皿を細胞培養インキュベーターに入れます。培地を吸引し、洗浄ごとに3ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。FBSと抗生物質を含むDMEM/F12を10ミリリットル加え、インキュベートします。
Oil Red O染色は、脂肪細胞分化誘導7日後に脂質を含んだ脂肪細胞を示した。完全分化の程度は、脂肪生成調節因子のmRNA発現解析により確認した。ロシグリタゾンは、Ucp1およびPpargc1aなどの褐色脂肪特異的遺伝子の発現レベルに対する用量依存的効果を誘導した。
しかしながら、Fabp4については、0.1マイクロモルのロシグリタゾン濃度で効果が飽和した。分化脂肪細胞は、酸素消費率解析やクロマチン免疫沈降など、さまざまな機能解析や機構解析に使用できます。
