Multiplex Immunofluorescence Staining and Image Analysis

マルチプレックス免疫蛍光染色の前に、組織を固定し、脱パラフィンおよび内因性ペルオキシダーゼ阻害を行います。次に、マルチプレックス免疫蛍光染色のために、スライドを0.1%Triton X-100で補完した10ミリモルのクエン酸緩衝液を含む300ミリリットルの染色ジャーに沈めました。蓋を閉めた状態で染色ジャーを電子レンジで最大電力で3〜5分間、バッファーが沸騰し始めるまで置きます。

沸騰後、電子レンジを低電力で15分間放置して、バッファーを沸騰温度近くに置いておきます。繰り返しますが、電子レンジを最大電力で90秒間入れてバッファーを加熱します。電子レンジからジャーを取り出し、バッファーを室温で15分間冷却します。

スライドを蒸留水でそれぞれ5分間3回すすぎ、続いて0.1%Tween 20またはTBSトゥイーンを含むトリス緩衝生理食塩水で5分間すすぎます。最後の洗浄後、ペーパータオルでスライドを吸い取ってTBSトゥイーンを取り外します。次に、スライドを顕微鏡のスライドボックスに置き、疎水性ペンで組織を囲みます。

TBSトゥイーンに溶解した5%BSAで組織を覆うことにより、非特異的結合部位をブロックします。30分後、ペーパータオルでスライドを吸い取ってブロッキングバッファーを取り外します。次に、組織を1%BSA、TBSトゥイーンで希釈した300マイクロリットルの一次抗体で60分間インキュベートします。

インキュベーション後、TBSトゥイーンでそれぞれ3分間スライドを3回すすぎます。洗浄後、組織を300マイクロリットルのPoly-HRP二次抗体と共に40分間インキュベートします。インキュベーション後、TBSトゥイーンでそれぞれ3分間スライドを3回すすぎます。

次に、組織を0.003%過酸化水素を即席補充したホウ酸緩衝液で200倍に希釈した300マイクロリットルの蛍光色素チラミド試薬で10分間インキュベートします。その後、スライドをTBSトゥイーンで3回すすぎ、1%BSA、TBSトゥイーンで希釈したヒト汎サイトケラチン抗体を用いて、組織を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、TBSトゥイーンで組織をすすぎ、1%BSA、TBSトゥイーンで200倍希釈した蛍光色素と直接結合した二次抗体で120分間インキュベートします。

インキュベーション後、TBSトゥイーンで組織をすすぎ、10%BSA、TBSトゥイーンで1, 000倍に希釈したビスベンズイミドで核を5分間染色します。蛍光封入剤とホウケイ酸カバーガラスを使用してスライドにマウントする前に、蒸留水でそれぞれ3分間組織を3回すすぎます。画像解析の場合は、スキャンを画像解析ソフトウェアにインポートします。

次に、[分析] タブに移動し、[設定]、[アクション]、[読み込み] の順にクリックして、ハイプレックス蛍光アルゴリズムを選択します。[色素選択]タブと目的の色素を選択します。核検出タブで、核セグメンテーションタイプに移動し、AIカスタムを選択します。

次に、核セグメンテーション分類器で、保存したトレーニング AI.In メンブレンおよび細胞質検出タブを選択し、最大細胞質半径とメンブレン色素の数を選択します。各色素について、核陽性閾値、細胞質陽性閾値、および膜陽性閾値を選択します。各色素について、完全性の核、膜、および細胞質の割合の値を選択します。

[設定]、[アクション]、および [保存] を選択してアルゴリズムを保存します。対象地域を分析するには、[解析] をクリックして [アノテーション レイヤー] を選択します。次に、[結果]タブに移動し、[オブジェクト データ]ですべてのデータを選択します。

[エクスポート] を右クリックして [オブジェクトデータ.csv] を選択して、データを CSV 形式でエクスポートします。マルチプレックス免疫蛍光による最適染色の代表的な結果が示されている。正しい希釈液を選択することは、抗体の特異性を検証し、染色のS/N比を最適化するために不可欠でした。