Intramuscular Adipose Tissue (IMAT) Visualization with Oil Red O Staining

0.5グラムのORO粉末を100ミリリットルのイソプロパノールに溶解してストック溶液を生成して、ORO溶液を調製します。OROストック溶液と脱イオン水を60対40の比率で組み合わせて、すべての筋肉用の作業溶液を準備します。作業溶液を10分間覆い、微粒子が沈殿するまで待ちます。

40マイクロメートルのメッシュでろ過し、続いて0.22マイクロメートルのシリンジフィルターでろ過します。次に、ウェルプレート内の脱細胞化筋肉からホルムアルデヒド溶液を除去し、等量のPBSで筋肉を3回洗浄します。次に、PBSを等量の60%イソプロパノール溶液と交換し、ロッキングシェーカー上で5分間インキュベートします。

完了したら、ロッキングシェーカーで10分間インキュベートする前に、60%イソプロパノール溶液をORO作業溶液と交換します。次に、ORO作業溶液を等量の1%SDSと交換し、SDS溶液を定期的に検査します。溶液が著しくピンク色になったら、SDS溶液を新しい1%SDSと交換します。

溶液が24時間透明なままになったら、1%SDSをPBSと交換します。4倍の倍率の実体顕微鏡で、汚れた筋肉の外側に付着している明らかな破片や微粒子を取り除きます。透明なマトリックスに浮かぶ真っ赤な球体を示す染色に問題がなければ、実体顕微鏡に取り付けたカメラを使用して染色画像を取得します。

適切に脱細胞化された筋肉は白く、半透明でした。脱細胞化した筋肉をOROで染色して筋肉内脂肪組織(IMAT)を可視化すると、透明な筋肉構造内にIMAT脂質滴が赤い球体として現れました。健康なマウスの後肢の筋肉は、心肺毒素またはグリセロールを注射された後肢の筋肉と比較して、赤または陽性の脂質がほとんどまたはまったくないことで証明される、わずかな自然なIMATを示しました。

不完全な脱細胞化は、最初のSDS処理の直後、または半透明の淡いピンク色の繊維としてORO染色のウォッシュアウト後に同定されました。不完全なOROクリアランスは、OROウォッシュアウト後に、明確なファイバーラインではなく、ピンクまたは赤の均一な背景として識別されました。