ダイズ子葉にアグロバクテリウム根粒菌を感染させるために、アグロバクテリウム・リゾゲネスPRI2659プラスミドの配列を用いてTIプラスミド遺伝子virD2を検出するプライマーを設計する。形質転換後、PCRキットを用いたPCRによりvirD2の保持についてアグロバクテリウムコロニーを試験する。virD2と目的の遺伝子の両方を含むアグロバクテリウム根圏コロニーを選択した後、目的のプラスミドのスペクチノマイシン1リットルあたり100ミリグラムを含むLBプレートにいくつかのコロニーをストリークします。
翌日、P200ピペットチップを使用して、LBプレートから長さ1.5センチメートルのアグロバクテリウムをこすり落とし、1ミリリットルのリン酸緩衝液に再懸濁します。再懸濁した細胞懸濁液および滅菌した超純水をアセトシリンゴンで希釈する。キュベットチューブを使用して600ナノメートルの光学密度で吸光度を測定します。
次に、バイオセーフティキャビネットで、滅菌したメスをアグロバクテリウム溶液に浸し、子葉の内面に沿って1ミリメートルの深さに切り込みを入れます。6〜8個の子葉を、アセトシリンゴンで発芽および栽培培地で飽和させたろ紙を含むシャーレに下向きに切りました。プレートを室温で16時間の写真撮影期間の下で3日間インキュベートします。
3日後、感染した子葉を毛深い根の成長、またはHRGプレートに移します。22°Cに設定された成長チャンバー内のプレートと100マイクロモルの光強度で、長さ2〜3センチメートルの二次根を持つ一次根が観察されるまで、16時間の写真期間でインキュベートします。3〜4週間後、カルスから成長し、滅菌メスと鉗子を使用して二次根を含む一次根を収穫します。
適切な抗生物質を含む選択HRGプレートに根を移し、さらに5日間成長させます。5日目に、長さ3〜6センチメートルの二次根を持つトランスジェニック毛状根を収穫します。蛍光タンパク質を観察する場合は、二次根に自己蛍光がほとんどないことを確認してください。
次に、エリシターまたは化学処理を行うために、二次根を1センチメートルの小片に切り、約100ミリグラムをHRG寒天に山に入れます。次に、80マイクロリットルの適切な処理溶液でパイルを飽和させ、プレートを室温でインキュベートします。24時間後、RNA抽出のために、滅菌したペーパータオルで根を素早く軽くたたいて乾かし、2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに直接収穫します。
すぐにパラフィルムを使用してチューブの上部を密閉し、先のとがった鉗子を使用して2つの小さな穴を開けます。形質転換アグロバクテリウム菌のコロニーPCR結果を示す。PCRにおける陽性コロニーは、目的の遺伝子を示した。
しかし、コロニーの3分の1から2分の1はvirD2遺伝子スクリーニングに対して陰性でした。蛍光顕微鏡は、GFP-GmJAZ1-6の細胞内局在を実証します。遺伝子発現解析により、ウィリアムズ82ハリー根におけるグリセオリン転写因子GmHSF6-1の過剰発現とGmMYB2912のRNAiサイレンシングが確認されました。
