Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR

5マイクロリットルのエレクトロポレーション一晩増殖L回転培養物を96ウェルプレートからPCRチューブに移します。細胞をスピンダウンし、上清を廃棄してから、ペレットを20マイクロリットルの20ミリモル水酸化ナトリウムに再懸濁します。サンプルを摂氏95度で5分間煮沸します。

ボルテックス、そしてサンプルを氷の上に置く前に一度沸騰を繰り返します。細胞をスピンダウンし、1マイクロリットルの上清化合物を取り、99マイクロリットルの氷冷DNAおよびRNAを含まない二重蒸留水に希釈します。標準PCR反応における鋳型DNAとして100倍希釈液を使用し、プラスミド特異的プライマーを使用し、大腸菌ミニプレップ由来のプラスミドを用いたポジティブコントロールが挙げられる。

PCR後、サンプルを氷上に置き、適切なローディング色素を1つのX濃度で添加します。サンプルを1%アゴラーゼゲル中のTAEバッファー中で110ボルトで30分間実行します。調製温度を変化させた形質転換LロータリーのコロニーPCRは、PCR成功率の異なる結果となった。

氷上で調製したサンプルは、室温で調製したものや室温で調製したものよりも高い成功率を示し、その後、PCRの前に摂氏37度で30分間インキュベートしました。