Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

まず、組織を滅菌組織培養プレートに入れ、余分な培地を取り除きます。滅菌金属定規で組織を測定し、写真を撮ります。切断した組織に3ミリリットルの高度なDMEM/F-12培地を加え、組織を上下にピペットで動かして洗浄します。

次に、3ミリリットルのPBSで組織を洗浄します。組織培養プレートから培地を吸引し、滅菌ブレードと2ミリリットルの消化培地を使用して細かく切断します。次に、組織を合計5ミリリットルの消化培地を含む50ミリリットルのチューブに集めます。

チューブを摂氏37度で1時間インキュベートします。定期的にピペッティングで上下に懸濁液を混合します。トリプシンを不活化するために、5ミリリットルの高度なDMEM/F-12をチューブに添加します。

次に、サンプルを70マイクロメートルの細孔ストレーナーでろ過し、大きな破片を取り除きます。次に、10%FBSを含む2ミリリットルのDMEMをフィルターの上部にピペットで移し、ピペットを使用して線維芽細胞培養用の破片と組織残骸を回収します。次に、線維芽細胞培養のために破片をプレーティングします。

濾液を室温で200〜300gで5分間遠心分離し、上清を吸引する。5ミリリットルの高度なDMF 12をペレットに加え、懸濁液を300 Gで5分間遠心分離します。赤血球溶解の場合は、ペレットを4ミリリットルの塩化アンモニウムカリウム溶解緩衝液に再懸濁し、15ミリリットルのチューブに移します。

細胞を室温で2分間インキュベートします。前に示したのと同じ条件で混合物を遠心分離した後、上清を吸引します。ペレットに5ミリリットルの高度なDMEM/F-12を加え、摂氏4度で再度遠心分離します。

上清を吸引した後、市販の細胞解離試薬1ミリリットルをペレットに加え、室温で2〜3分間インキュベートします。インキュベーション後、上清を遠心分離し、再度吸引する。次に、ペレットを5ミリリットルの高度なDMEM/F-12に再懸濁します。

懸濁液をP1000ピペットで複数回ピペッティングすることにより、細胞凝集を解離します。懸濁液を遠心分離し、上清を除去します。次に、事前に冷却したP1000およびP200ピペットチップを入手し、P1000ピペットに固定されたコールドチップを使用して細胞ペレットをメンブレンマトリックスに再懸濁してから、Falconを氷上に置いて固化を防ぎます。

インキュベーターから予熱したプレートを入手します。48マイクロリットルにセットしたP200ピペットを使用し、コールドチップを使用して、予熱したプレートに基底膜マトリックスドームを作成します。次に、それをインキュベートして基底膜混合物を固化させます。

マトリックスが固まったら、成長因子と阻害剤を添加した2〜2.5ミリリットルの高度なDMEM/F-12を加えます。腫瘍細胞を単離し、腫瘍オルガノイドを15日間かけて新鮮組織から樹立した。時折、細胞破片の量が多いと、発生中の腫瘍オルガノイドの正確な可視化が妨げられます。

発生中のオルガノイドは、腫瘍の起源に応じて、単離された、丸みを帯びた培養物から、スフェロイド状または凝集体様の培養物まで、表現型が異なることが観察されました。オルガノイド培養物は、原発腫瘍細胞培養の一般的なPI産物である線維芽細胞によって汚染されている可能性があります。約7日間の培養後、線維芽細胞は基底膜マトリックスドームから移動して細胞プレートに付着し、最適なオルガノイド増殖を損なう可能性があります。

線維芽細胞培養は、フィルターから回収された組織破片から確立されます。細胞は組織破片から遊走し、培養プレートに付着します。