まず、部屋の明かりを消します。FlowViewソフトウェアの接眼パネルの下にある接眼レンズを選択します。キューブタレットを4つのTRITCに変更し、ソフトウェアのタッチパネルコントローラーのバックライトの下でクリックしてタッチパネルコントローラーの電源を切ります。
次に、コンピューターの画面をオフにします。顕微鏡の黒い布カバーの前面を開きます。ブラックボックスから胚が入った35ミリのガラス底皿を取り出し、顕微鏡ステージに置きます。
次に、蛍光照明ユニットをオンにし、接眼レンズを使用して目的の胚を識別します。焦点を合わせます。サンプルを光から保護するために、黒い布カバーを閉じます。
コンピュータ画面の電源を入れて、顕微鏡を制御するソフトウェアにアクセスします。画像取得用のソフトウェアで接眼レンズをLSMに変更します。対照の無刺激胚において、倍率25倍の水浸対物レンズを用いてレーザーアブレーションを行う。
ツールウィンドウから「明るいZ」、「シーケンスマネージャー」、および「LSM 刺激」をクリックします。スキャナーの種類を Galvano に設定し、スキャン サイズを 512 x 512 に設定します。PMT設定パネルの下にあるチャンネル1とチャンネル3をオンにして、1040ナノメートルのレーザーを使用できるようにし、ライブを4倍の速度でクリックして胚を視覚化します。
回転機能を使用して胚を回転させ、前後軸を垂直に向け、ズームを3に設定します。スキャン設定のシェイプツールを使用して関心領域またはROIを描画し、参照パネルでROIサイズを設定します。次に、ROIを幅512ピクセル、高さ100ピクセルに設定します。
アブレーション前のZスタックの取得パラメータを設定するには、Zセクションの下に胚の表面をゼロとして登録します。始点を 0、終点を 100 マイクロメートルに設定します。ステップサイズを2マイクロメートルに設定し、[シリーズ]タブの[Z]をチェックしてZ取得モードをアクティブにします。
明るいZ機能を使用して、1040ナノメートルのレーザー強度を3%から7%に直線的に増加するように設定しますシーケンスマネージャーでLSMをクリックして、現在のイメージング設定をパイプラインの最初のタスクとして保存します。アブレーション前の動画の取得パラメータを設定するには、前述のように、胚の腹面付近のROIを512 x 512ピクセルに設定します。1, 040ナノメートルのレーザー強度を3%に設定しますチェック時間、およびシリーズパネルの下のZのチェックを外します。
タイムラプスパネルの下で間隔をフリーランとして保持し、サイクルを10に設定します。現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存するには、シーケンス マネージャーで [LSM] をクリックします。レーザーアブレーションのパラメータを設定するには、卵子膜のすぐ下に3D領域を定義します。
Z スタックの始点を平面として設定し、終点を 20 マイクロメートル深く設定します。ステップ サイズを 1.5 マイクロメートルに設定します。PMT設定パネルの下にあるチャンネル2とチャンネル4をオンにして、920ナノメートルのレーザーを使用できるようにします。
レーザーの強度を30%に設定し、定義された3D領域内の単一のZスタックに対してレーザーによる画像取得を設定します。現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存するには、シーケンス マネージャーで [LSM] をクリックします。アブレーション後の動画の取得パラメータを設定するには、1、040、920ナノメートルのレーザーを使用して、100フレームのシングルZ平面のアブレーション後の動画の画像取得を設定します。
レーザーの強度を3%と0.3%に設定しますシーケンスマネージャーでLSMをクリックして、パイプラインの次のタスクとして現在の設定を保存します。[取得] の下のシーケンスを選択します。必要に応じて、データの保存パスとファイル名を変更します。
[準備完了] をクリックし、ソフトウェアがパイプラインを初期化するのを待ってから、[開始] をクリックしてパイプラインを実行します。刺激された胚でレーザーアブレーションを実行するには、刺激されていない胚について実証されているように、アブレーション前のZスタックの取得パラメータを設定します。現在の設定をパイプラインの最初のタスクとして保存するには、シーケンス マネージャーで [LSM] をクリックします。
定義されたROI内で光遺伝学的刺激のパラメータを設定するには、ズームを1に変更し、胚の腹面をカバーするROIを選択します。チャンネル1からチャンネル4の検出器をオフにし、[LSM刺激]をクリックして、[持続時間内の連続]のチェックを外して、「12秒」と入力します。現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存するには、シーケンス マネージャーで刺激をクリックします。
刺激後3分の待機時間を設定して、ミオシンと頂端F-アクチンの分解を完全に不活性化し、レーザーアブレーションの前に静的な組織形態を実現します。次に、1、040、および920ナノメートルのレーザーが画像取得に使用されることを除いて、刺激されていない胚について実証されたように、単一のZ平面前アブレーションムービーの取得パラメータを設定します。チャンネル1からチャンネル4の検出器をオンにします。
レーザーの強度を3%と0.3%に設定しますシーケンスマネージャーでLSMをクリックして、パイプラインの次のタスクとして現在の設定を保存します。刺激されていない胚について実証されているように、レーザーアブレーションのパラメータを設定します。現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存するには、シーケンス マネージャーで [LSM] をクリックします。
単一Z平面のアブレーション後の動画の取得パラメータを、無刺激胚で実証されているように設定します。現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存するには、シーケンス マネージャーで [LSM] をクリックします。[取得] の下のシーケンスを選択します。
必要に応じて、データの保存パスとファイル名を変更します。[準備完了] をクリックし、ソフトウェアがパイプラインを初期化するのを待ってから、[開始] をクリックしてパイプラインを実行します。頂端狭窄を起こした無刺激胚では,スパゲッティスカッシュmCherryは内側頂端部で濃縮されたが,CRY2Rhoは1つの優性陰性mCherryは細胞質であった。
刺激された胚では、CRY2Rho1つの優性陰性mCherryシグナルが原形質膜に局在化したのに対し、スパゲッティスカッシュmCherryの内側頂端シグナルは完全に消失した。狭窄領域内の刺激されていない胚のレーザーアブレーションは、前後軸に沿った急速な組織反跳をもたらしたが、刺激された胚におけるレーザーアブレーションは顕著な組織反跳をもたらさなかった。アブレーションを定量化し、ここに示した。
