まず、消化および拡張したアーカイブまたは新鮮な臨床組織サンプルを採取し、6ウェル細胞培養プレートの1つのウェルに入れて抗体染色を進めます。サンプルをPBSで室温でそれぞれ10分間3回洗浄します。サンプルサイズに応じて、ゲルを適切に覆うために染色バッファーに0.5〜2ミリリットルの一次抗体を追加します。
摂氏37度で一晩インキュベートします。その後、サンプルをPBSで3回、室温でそれぞれ10分間洗浄します。対応する二次抗体を添加し、選択した染色バッファー中で摂氏37度で3時間インキュベートします。
前に示したようにサンプルを再洗浄し、1〜2ミリリットルのポリエチレングリコールを6ウェルプレートのサンプルに追加します。サンプルをFluor 4結合NHSエステルで室温で3時間染色します。インキュベーションの最後に、サンプルをPBSで3回洗浄します。
次に、脂質染色を行うには、PBSで3回洗浄した膨張組織サンプルを採取し、2ミリリットルの0.1%Triton X-100またはPBSで200倍に希釈した従来の親油性色素を室温で72〜96時間塗布し、PBSで少なくとも3回洗浄します。FISHを行うには、2 x SSC、10%デキストラン硫酸、20%エチレンカーボネート、および0.1%Tween 20を組み合わせてハイブリダイゼーションバッファーを調製します。ホモジナイズしたゲルサンプルを、摂氏60度で30分間予熱したハイブリダイゼーションバッファーに入れます。
次いで、ゲルサンプルを、標的遺伝子に対する10ピコモルFISHプローブを含むハイブリダイゼーションバッファーとともに、摂氏45度で一晩インキュベートします。ストリンジェンシーウォッシュバッファーでサンプルを45°Cで15分間2回、37°Cで10分間2回洗浄します。サンプルをPBSで10分間3回洗浄し、イメージングに進むか、サンプルをPBSと摂氏4度の0.02%アジ化ナトリウムに保存します。
組織を完全に拡大して画像化するには、PBSで4倍に拡大したサンプルをガラス底の6ウェルイメージングプレートに移動します。サンプルがさらに拡大されている場合は、それをより小さな断片に切断します。ガラス表面に0.1%ポリリジンを塗布します。
サンプルをスライドに置き、イメージング中のゲルの移動を防ぐために、紙の実験布でゲルの周りの余分な液体を取り除きます。その後、従来の広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、または選択した別のイメージングシステムを使用して蛍光イメージングを実行します。イメージング後、脱イオン水中での長期保存は蛍光シグナルの低下につながるため、少なくとも3回の10分間の洗浄でPBSでサンプルを収縮させます。
最後に、サンプルを摂氏4度の0.02%アジ化ナトリウムを含むPBSに保存します。完全に拡張されたマウス脳組織の共焦点画像により、タンパク質と細胞およびミトコンドリアの膜構造の視覚化が可能になりました。ホルマールおよび固定パラフィン包埋ヒトリンパ節組織の核酸も同定された。
腎臓切片の3.5倍の拡張後、亀裂のない拡張糸球体が見られました。しかし、不十分な固定または均質化は、亀裂、歪み、および別の腎臓切片の標識された標的の喪失をもたらしました。
