まず、12ミリリットルのDMEMに200万個のpan02細胞を接種し、摂氏37度、湿度95%、二酸化炭素5%、空気35%でインキュベートします。48時間後、培養液を28gで2分間遠心分離し、上清を捨てる。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに1ミリリットルの2.5%グルタルアルデヒドを摂氏4度で一晩加えて細胞を固定します。
翌日、サンプルを1006 gで5分間遠心分離し、固定液を吸引してから、サンプルを0.1モルのPBSで2回すすぎます。続いて、サンプルを二重蒸留水でそれぞれ10分間2回すすぎます。次に、1%四酸化オスミウムと1.5%フェロシアン化カリウムの50マイクロリットル溶液を1対1の割合で加え、摂氏4度で1時間インキュベートします。
サンプルを遠心分離し、0.1モルのPBSで2回、二重蒸留水で1回すすぎます。次に、1ミリリットルの1%チオカルボヒドラジドを加え、室温で30〜60分間インキュベートします。インキュベート後、遠心分離し、サンプルを二重蒸留水で4回すすぐ前に上清を捨てます。
次に、50マイクロリットルの1%四酸化オスミウムを加え、室温で1時間固定します。再度遠心分離し、サンプルを二重蒸留水で4回すすぎます。1ミリリットルの2%酢酸ウラニルを加え、摂氏4度で一晩染色します。
サンプルを二重蒸留水ですすいだ後、1ミリリットルのウォルトン溶液を加え、摂氏60度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を二重蒸留水で4回すすぎ、段階的エタノールシリーズでそれぞれ10分間脱水します。次に、1ミリリットルの100%アセトンでそれぞれ10分間2回脱水します。
次に、200マイクロリットルのアセトンとPon 812エポキシ樹脂を3対1、1対1、および1対3の比率で混合します。サンプルを室温で樹脂にそれぞれ2、4、および4時間浸し、それぞれインキュベートした後、サンプルを100%Pon 812エポキシ樹脂に一晩含浸させた。翌日、試験片を平らな埋め込み型に移し、摂氏60度のオーブンで48時間重合します。
重合後、ウルトラミクロトームを用いて、加水分解シリコンウェーハ上に厚さ70ナノメートルの連続スライスストリップを収集し、摂氏60度のオーブンで10分間乾燥させます。
