導電性カーボンテープを切断し、膵臓細胞切片とSEM標本ステージに装着したシリコンウェーハの間に貼り付けます。次に、FESEM加速電圧を4ミリメートルの動作距離で2キロボルトに設定します。上部のメニューバーで、HLアイコンをクリックします。
次に、低倍率で、ターゲットスライスストリップの最初のセクションの向きを変え、もう一度HLアイコンをクリックして高倍率モードに切り替えます。画像の明るさ、コントラスト、および倍率を調整して、目的の構造に適した画像を収集します。次に、[プロジェクトビュー]、[データを開く]の順に選択し、分析する画像ファイルをソフトウェアにインポートします。
[スライスの整列と編集]をクリックして画像を整列します。次に、左下のメニューバーで、画像の透明度を変更して強度範囲の値を調整します。[サブボリュームの抽出] モジュールを選択し、スタック全体の重複部分のサイズに合わせて整列されたデータ セットをクリックします。
次に、セグメンテーションサブセクションで、[リサンプル]、[セグメンテーション]の順に選択し、[保存]をクリックします。次に、魔法の杖のしきい値とブラシツールのサイズを選択して、正しい範囲を選択します。[選択]メニューから、[追加]アイコンをクリックして、選択した領域を追加します。
地域セグメンテーションが完了したら、オブジェクトのサイズと画像の解像度に対して最良の結果に従って画像ファイルを生成します。[切り抜きエディタ]をクリックし、[仮想スライダー]ボックスに数字の6を入力します。次に、左側のドロップダウンメニューから、[プロジェクト]サブセクションの下の灰色の領域を右クリックし、[サーフェスを生成]、[作成して適用]の順に選択します。
生成されたファイルで、サーフェスビューモジュールを使用して、サーフェス構造と3D表現を作成します。2D FESEM画像は、対照群では、ミトコンドリアが規則的なクリステ構造で均等に分布していたことを明らかにしています。対照的に、RSL3群は、膜密度の増加と曖昧なクリステ構造を伴う収縮したミトコンドリアを示しました。
しかし、RSL3群ではすべてのミトコンドリアクリステが変性したわけではなく、一部は無傷のままでした。RSL3群と比較して、阻害剤群はほとんど無傷のクリステ構造を有し、ほんのわずかしか明らかではなかった。対照群の3D画像は、ミトコンドリアとそのクリステ構造のより正確なビューを提供しました。
RSL3群の3D画像は不規則で空胞化したミトコンドリアを示し、阻害剤群は多様なクリステ形状を示した。ミトコンドリアの変化の定量化は、RSL3群が対照群と比較してミトコンドリアの長さと体積を有意に減少させたのに対し、阻害剤群は中間結果を示したことを示しました。RSL3はまた、ミトコンドリアの形態を変化させ、フェロトーシスを引き起こすことにより、ミトコンドリアの機能不全を引き起こし、細胞代謝を変化させました。
