Generation of Rat Intestinal 2D Monolayers from 3D Organoids

プレートをEMEでコーティングするには、EME 1をコールドアドバンストDMEM +で20に希釈しますコラーゲンでコーティングする場合は、アドバンストDMEM +でコラーゲンIを1ミリリットルあたり5ミリグラムから100マイクログラム/ミリリットルに希釈します。200マイクロリットルの希釈EMEまたはコラーゲンをプレートでコーティングしてウェル表面を完全に覆い、摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。単分子膜を生成するには、オルガノイドを含む35mmプレートから培地を吸引します。

1ミリリットルのPBSを添加し、P1000チップでウェル内のEMEを破壊し、ピペッティングを約20回行い上げてすべてのEMEを緩めます。内容物を15ミリリットルの円錐形チューブに移します。プレートに1ミリリットルのPBSを加えて追加のオルガノイドを回収し、同じコニカルチューブに移します。

サンプルを 350 G で 2 分間遠心分離し、EME 残渣を含む上清を除去します。次に、オルガノイドペレットに1ミリリットルのトリプシン溶液を加え、摂氏37度で2分間インキュベートします。P1000チップを使用してピペットで10回上下させ、2ミリリットルのAdvanced DMEM+を加えてトリプシンを中和します。

350 G で 5 分間遠心分離し、上層体を吸引してから、ペレットを 4.8 ミリリットルの rIOM2D に再懸濁します。Advanced DMEM+の余分なEMEまたはコラーゲンをウェルから除去します。次に、200マイクロリットルのオルガノイドをrIOM2Dに添加し、10マイクロモルのY27632をプレコートウェルに添加します。

4〜16時間後、培地を回収し、1, 000 Gで1分間遠心分離します。上清を新しい15ミリリットルのコニカルチューブに移し、ペレットを廃棄します。各ウェルを300マイクロリットルのPBSで洗浄してから、遠心分離したrIOM2Dを各ウェルに200マイクロリットル添加します。

rIOM2Dを2〜3日ごとに交換し、EMEを細胞の上部に戻すと容易に小さなスフェロイドに再形成されるEMEにプレートされたY27632.2D単分子膜の使用を一時停止します。対照的に、コラーゲンI基質は3D構造を改質するには不十分でした。