まず、あらかじめ装着した24ウェル培養プレートを取り、各ウェルにガラスカバースリップを置きます。次に、10%FBSとDMEMを含む800マイクロリットルの培地を追加します。細胞濃度を調整した後。
摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。その後、培養液を廃棄し、細胞をPBSで洗浄します。BSAを含む800マイクロリットルのDMEM誘導培地に細胞を懸濁します。
リノール酸を無水エタノールに溶解し、1リットル当たり100ミリモルの濃度の標準溶液を調製した。プレートに勾配を上げてリノール酸を加え、4回繰り返します。次に、プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。
インキュベーションの最後に、培養液を取り除き、細胞をPBSで3回洗浄します。400マイクロリットルの4%パラフォームアルデヒドで20分間固定します。その後、固定液を捨ててもう一度洗います。
細胞を60%イソプロピルアルコールで5分間インキュベートし、その後廃棄します。調製したてのオイルレッドO作業溶液を加え、20〜30分後に廃棄します。余分な色素溶液が除去されるまで、細胞をPBSで2〜5回洗浄します。
核を300マイクロリットルのヘマトキシリン溶液で1〜2分間再染色します。次に、染料溶液を廃棄して、もう一度洗浄します。PBS洗浄プレートからガラスカバースリップを取り外し、10マイクロリットルの錠剤シーラントを含む顕微鏡スライド上に細胞を下に向けて置きます。
LDのサイズと数を測定するには、コンピューターと顕微鏡のスイッチを連続してオンにし、スライドをローディングプラットフォームに置きます。次に、画像解析ソフトウェアを開きます。低電力で画像を見つけ、イメージングスライドに適切な量の杉油を滴下します。
対物レンズを200倍に徐々に調整し、鮮明な画像が見つかるまで視野を調整します。次に、目的の領域から画像をキャプチャして保存します。ランダムに、各画像に対して60個のLDを選択し、直径を測定します。
測定結果をテーブルにエクスポートして、LDの平均サイズと分布比を分析します。染色された肝細胞培養細胞は、異なるサイズおよび数のLDを示した。リノール酸処理の異なる濃度の下で。
細胞当たりのLDの数は、リノール酸の濃度の違いと負の相関があった。細胞当たりのLD数の中央値は、リノール酸処理群100マイクロモル/リットルで136であり、高濃度で減少した。対照群のLDの平均直径は0.72マイクロメートルであり、リノール酸処理群の濃度の増加とともに増加しました。
リノール酸濃度が高いと,大きなLDの割合が増加し,小さなLDが減少した。
