まず、解凍した液滴デジタルまたはddPCRマスターミックスを取り、室温でプローブ、フォワードプライマー、リバースプライマーを加えます。スクリーンに示されている推奨組成に従って各増幅ターゲットのマスターミックスを調製し、必要に応じてプライマーとプローブの濃度を調整します。混合物を徹底的にボルテックスし、ミニ遠心分離機で短時間遠心分離します。
制限酵素を加え、反転させて混ぜます。次に、調製したマスターミックス16.5マイクロリットルをPCRプレートの各ウェルに加え、プレートを透明粘着フィルムで密封します。サンプル希釈バッファーを希釈液として使用し、バリデーション精度と精密分析の推奨濃度を表すこの表に概説されている品質管理またはQC希釈液を調製します。
0.2ミリリットルのPCRチューブでサンプル希釈バッファーで涙液サンプルを1対10の比率で希釈し、チューブを密封します。サーモサイクラーでサンプルを摂氏95度で10分間加熱し、次に摂氏4度で少なくとも5分間加熱します。マスターミックスを含むddPCRプレートから接着フィルムを取り出し、プレートマップに示すように、5.5マイクロリットルのQC希釈液を96ウェルプレートの適切なウェルに追加します。
次に、5.5マイクロリットルのサンプルをウェルに追加します。5.5マイクロリットルのサンプル希釈バッファーをテンプレートなしコントロールまたはNTCウェルに追加します。ヌクレアーゼフリー水を使用して2x ddPCRバッファーコントロールを1対2の比率で希釈し、22マイクロリットルのバッファーをカラムの空のウェルに追加します。
プレートに穴を開け可能なホイルシールを追加し、プレートをプレートシーラーに置きます。プレートを摂氏180度で5秒間密封します。プレートを最高速度で少なくとも30秒間ボルテックスし、プレートスピナーで短時間遠心分離します。
自動液滴発生器のタッチスクリーンで、サンプルを含むプレートマップ上の列を選択します。機器のデッキが点灯し、必要な消耗品が示されます。液滴発生器を後ろから前にロードします。
黄色のライトが黄色から緑色に変わり、消耗品の十分性を示します。コールドブロックと液滴プレートホルダーを置きます。ブロックが完全に青色で、ピンクが見えないことを確認します。
新しい96溶接ddPCRプレートをコールドブロックに配置します。準備したPCRプレートをサンプルプレートホルダーに入れます。機械の蓋を閉め、スタートを押して液滴を生成します。
30分以内に、液滴を含むプレートをコールドブロックから取り出します。プレートに穴を開け可能なホイルシールを追加し、プレートをプレートシーラーに置きます。摂氏180度で5秒間密封します。
次に、プレートを互換性のあるサーマルサイクラーに置き、画面に表示されるサイクリング条件を入力します。プレートを液滴リーダーにロードし、十分なリーダーオイルが残り、廃棄物容器に十分なスペースがあることを確認します。最後に、ソフトウェアの読み取りボタンを押して、液滴の読み取りを開始します。
各アッセイにおける各濃度のアッセイ内平均を計算し、これをアッセイの精度および精度を評価するために使用した。すべてのQCレベルで、平均アッセイ間精度は7.7%、平均絶対アッセイ間精度は4.2%でした。アッセイ間の精度および精度も、各バッチ内の各QCレベルのアッセイ間平均を用いて計算した。
4〜8.5%の範囲のアッセイ間精度と1〜3.2%の範囲のアッセイ間絶対精度が見つかりました。同様に、涙液サンプルでは、高スパイクレベルで3.7%、低スパイクレベルで12.2%の平均アッセイ間精度、高レベルで11.3%、低レベルで8.1%の平均アッセイ間絶対精度が観察されました。アッセイ間計算の場合、高レベルで5.5%、低レベルで7.1%の精度、高レベルで11.3%、低レベルで8.1%の絶対精度が見られました。
