凍結した哺乳類組織から単一核を単離した後、ピペットチップを使用して解離剤カートリッジの丸いホイルに慎重に穴を開けます。スクロースグラジエントのクリーンアップを容易にするために、カートリッジから900マイクロリットルの核懸濁液を取り出し、2ミリリットルのチューブで調製した500マイクロリットルのスクロースクッション溶液またはSCSに加えます。混合物が均一になるまでピペッティングでよく混合します。
次に、チューブを斜めに保持し、1, 400マイクロリットルの核懸濁液SCS混合物を新しい500マイクロリットルのSCSに滴下して慎重に加え、はっきりと見える相分離を作成します。チューブを慎重に閉じ、相分離を妨げずに氷上に戻します。予冷された遠心分離機で、13 、 000 g のチューブを摂氏 4 度で 15 分間慎重に回転させます。
パレットを乱さずに上清を取り除き、パレットを50マイクロリットルの氷冷NSRに慎重に再懸濁します。同じサンプルの2つのパレットを新しい1.5ミリリットルのチューブに入れます。900マイクロリットルの氷冷NSRを総容量1ミリリットルに添加し、ピペッティングでよく混合します。
サンプルを500gで5分間、摂氏4度でスイングバケットローター遠心分離機で遠心分離します。上清を除去し、ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。計数には、10マイクロリットルの核懸濁液を20マイクロリットルのPBSで希釈します。
25マイクロリットルのヨウ化プロピジウム染色溶液を、蛍光カウンター計数プレートの混合ウェルに加えます。次に、25マイクロリットルの希釈核懸濁液を加え、ピペッティングでよく混合します。染色したサンプル50マイクロリットルを混合ウェルからローディングウェルに移します。
セルカウンターに計数プレートをロードし、カウントを開始します。計数後、サンプルをPBSで希釈し、一核RNAシーケンシングに必要な濃度にします。部分的に自動化された核単離プロトコルを使用して、ブラビング、破片、凝集の兆候のない高品質の核が得られました。
各サンプルの遺伝子数、UMI数、ミトコンドリア含有量の分布を表すバイオリンプロットが示されています。各組織から予想される細胞タイプが同定され、すべての動物がすべてのクラスターに寄与し、プロトコルによってもたらされた技術的変動性が低いことが示されました。さらに、細胞の割合、UMI数、および遺伝子数は、組織タイプごとに3つのサンプルすべてで同等でした。
