3Dプリントされたバイオリアクターでの血管の灌流培養

3Dプリントされたバイオリアクターを使用して灌流培養用のサンプルを調製します。層流キャビネットで、単離されたブタ頸動脈サンプルを低温輸送媒体に入れます。メスの刃を使用して、余分な結合組織を取り除き、組織の端を切り取ります。

次に、組織を低温輸送媒体で2回洗浄します。次に、組織を輸送媒体に入れ、オービタルシェーカーに最低30分間置き、完全に最終洗浄します。その後、2つの有刺鉄線ルアー接続を使用して、洗浄した動脈の非分岐セグメントを作製したバイオリアクターシステムに接続します。

そして、血管シリコンタイで作られた血管ボンドを使用して固定します。最初のルアー接続部に取り付けられた小さな注射器を使用して、動脈に培地を静かに流し、開存性を確保します。作製したインサートに動脈を固定した後、反応空間を灌流媒体で満たします。

次に、管腔循環ループを慎重に培地で満たし、システムから残っている空気を取り除きます。最後に、反応空間を組み立てられた灌流システムに接続し、循環を完了します。灌流培養を行うには、灌流システムをインキュベーターに入れます。

蠕動ポンプに接続した後、圧力センサーなどの追加の取得システムを接続します。毎分約10〜15ミリリットルの低媒体流量で一晩平衡化します。翌日、毎分35ミリリットルの最終流量が達成されるまで、流量を徐々に増やします。

3日ごとに、新しい培地の入った1本のシリンジをポンプに近い培地交換ポートに接続し、空のシリンジをリザーバーに近いポートに接続して、使用済みの培地を回収して、培地の50%を交換します。実験後、滅菌手術用ハサミを使用して、バイオリアクターに接続された組織端をトリミングすることにより、反応チャンバーから組織を採取します。内皮および平滑筋特異的マーカーを用いた共焦点イメージングにより、採取時から洗浄・加工、さらには灌流培養後に至るまで、動脈の正常な構造が良好に維持されていることが明らかになりました。

しかし、処理中の誤った取り扱いにより、培養前に内皮が失われ、高流量の突然の開始などの非生理学的培養条件を適用すると、管腔の損傷が示されました。採取時および7日間の灌流培養後のヘマトキシリン染色および免疫蛍光染色を用いた組織の組織学的評価により、血管壁内の細胞の形態および全体的な分布が終生維持されていることが明らかになりました。