血小板受容体アゴニストであるコラーゲン関連ペプチド架橋(CRPXL)を使用してアッセイを開始するには、アッセイバッファー中のCRPXLストックを、最大の血小板凝集を誘導するのに適した濃度に希釈します。結果として得られるソリューションは、以降、標準と呼ばれます。次に、同じ調製濃度から開始して、標準試薬と試験試薬の両方について2倍段階希釈を順次実行します。
100%から0%までの凝集反応を生成するアッセイバッファーで、試験と標準液の両方について6〜8ポイントの希釈シリーズを調製します血小板多血漿(PRP)を使用する準備ができたら、PRPのアリコートを光透過アグリゴメトリーキュベットに添加します。保持ウェル内でサンプルを摂氏37度まで数分間温めます。適切に温められたら、キュベットを凝集計に入れてトレースの記録を開始します。
絶え間なく攪拌しながら、アゴニストを添加し、データを記録します。調製した標準液と試験試薬の希釈液ごとにデータ収集を行います。Graphpad Prismまたは適切なソフトウェアパッケージを使用して、標準試料と試験の濃度曲線が平行であることを確認します。
X軸に濃度が含まれ、Y軸に最大凝集のパーセントまたは曲線下の面積で示される応答が含まれるようにデータを入力します。次に、濃度値を対応する対数、つまり対数濃度に変換します。解析関数から非線形回帰を選択し、用量反応刺激の式を使用します。
対数アゴニストと応答変数の傾きを選択し、データに最適な方法に応じて、3元または4元近似を使用します。生成された曲線が平行かどうかを判断するには、比較タブをクリックしてデータセットを比較します。検定の傾きと漸近線、および検定曲線が等しいことを確認します。
これらの条件が満たされている場合は、非線形回帰曲線フィッティングを使用してポテンシー(EC50)の計算に進みます。標準試料のEC50値を試験値で割って、相対的な効力を計算します。試験試薬の体積濃度あたりの質量を調整して、標準試料に対する力価の差を考慮します。
標準試薬と試験試薬の血小板凝集トレースにより、2 つの凝集レスポンスの違いが明らかになりました。0.075マイクログラム/ミリリットルでは、基準値に対する明確な反応が見られましたが、テストでは、対応する濃度は反応を示しませんでした。標準試薬および試験試薬のEC50値は、濃度応答曲線をプロットして計算しました。
