まず、ポリ(A)濃縮RNAを単離するために、10〜20マイクログラムの高品質トータルRNAを調製します。RNAのアリコートをヌクレアーゼフリーの1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。チューブをヒートブロック内で摂氏70度で5分間インキュベートし、氷上に2分間置きます。
オリゴ(dT)ビーズを再懸濁した後、必要な量のビーズ懸濁液を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、磁気ビーズがペレットを形成するまで磁石上に3分間置きます。上清を除去し、等量の溶解緩衝液を添加します。ビーズを再懸濁します。
チューブを磁石に戻し、3分間、上清を取り除きます。最初の精製では、溶解バッファーをRNAサンプルチューブに添加し、十分に混合します。次に、混合物をオリゴ(dT)ビーズに移し、ピペッティングで完全に10回以上再懸濁します。
サンプルを室温で連続的に回転させてインキュベートします。15分後、サンプルを磁石の上に5分間、または上清が透明になるまで置きます。上澄みを捨てます。
600マイクロリットルの洗浄バッファー1をビーズに加え、慎重に混合して再懸濁します。次に、300マイクロリットルの洗浄バッファー2をビーズに加え、慎重に混合して再懸濁します。チューブを磁石の上に5分間、または上澄みが透明になるまで置きます。
上澄みを捨てます。次に、30マイクロリットルの冷たい10ミリモルトリスHCLをサンプルチューブに加え、摂氏70度でインキュベートします。5分後、チューブを磁石にすばやく移します。
懸濁液が透明になったら、溶出したポリ(A)濃縮RNAを含む上清を新しい1.5 mmリットルの微量遠心チューブに移します。2回目の精製では、溶出したRNAサンプルに120マイクロリットルの溶解緩衝液を加え、完全に混合します。最初の精製で使用したビーズを等量の溶解緩衝液で洗浄します。
ピペットで10回ビーズを再懸濁し、チューブを磁石の上に5分間置いてから上清を廃棄します。RNA溶解バッファー混合物を洗浄したビーズに移し、ピペッティングで完全に混合します。前述したようにビーズを洗浄した後、25マイクロリットルの冷たい10ミリモルトリスHCLをサンプルチューブに加え、摂氏70度でインキュベートします。
5分後、チューブをマグネットにすばやく移し、懸濁液が透明になったら、溶出したポリ(a)濃縮RNAを含む上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、亜硫酸水素塩変換のために、精製されたポリ(A)濃縮RNAサンプル19マイクロリットルを0.2ミリリットルの8ストリップチューブに移し、所定の1〜10、000数量比で1マイクロリットルのスパイクコントロールを追加します。130マイクロリットルの変換試薬をチューブに加え、十分に混合した後、チューブをPCR装置に入れ、PCRプログラムを開始します。
PCR後、カラムをコレクションチューブにセットし、250マイクロリットルのRNA結合バッファーをカラムに添加します。次に、150マイクロリットルの亜硫酸水素塩処理サンプルをカラムに移し、ピペットで完全に移します。400マイクロリットルの95〜100%エタノールをカラムに加え、キャップをすばやく閉じて数回反転させます。
遠心分離、洗浄、脱硫緩衝液による中和を繰り返した後、カラムを新しい1.5 mmリットルの微量遠心チューブに移します。カラムに20〜30マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、1分間放置します。25の摂氏温度で30秒間10、000 Gで遠心分離し、2.2マイクロリットルの上清を8本のストリップチューブに移してRNAの量と質を評価します。
ポリ(A)RNA濃縮効率をキャピラリー電気泳動トータルRNAアッセイで評価したところ、膵臓がん細胞株の二重精製後にリボソームRNAのコンタミネーションが減少しました。亜硫酸水素塩処理前後のRNA量をキャピラリー電気泳動で評価した。亜硫酸水素塩処理後、RNAサイズ分布は、亜硫酸水素反応による断片化により、200〜500ヌクレオチドのピークを示しました。
アンプリコンのキャピラリー電気泳動では、プライマーの残存が最小限で、過剰増幅ピークがなく、ライブラリ調製が成功しました。シーケンシングリードが参照配列にアライメントされた後、総リードの平均2, 440がスパイク配列にマッピングされ、解析されたCからTへの変換率の合計は平均99.81%に達しました
