まず、市販のタンパク質濃縮キットのスピンカラムからトップキャップとボトムキャップを取り外し、将来の使用のために保持します。キャップなしスピンカラムを2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。セットアップを1000Gおよび室温で30〜60秒間遠心分離し、保存溶液を取り出して廃棄します。
スピンカラムの濃縮ビーズに200マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、ピペッティングで数回上下させて混合します。前述したようにスピンカラムを遠心分離した後、回収したバッファーを廃棄します。トップキャップを交換する前に、ボトムキャップを元に戻し、スピンカラムに200マイクロリットルの水を加えます。
調製したビーズ水性スラリーをピペッティングで上下に混合してから、40マイクロリットルをあらかじめ調製したモノクローナル抗体製剤サンプルに移します。チューブを室温で2時間回転させてインキュベートします。次に、16ゲージの針を使用して適切なサイズのフリットに穴を開け、200マイクロリットルのチップの先端に挿入します。
ビーズ付きのサンプルを準備したチップに移し、トップキャップに穴の開いた2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。チューブ内のチップを遠心分離して溶液を除去します。チップに200マイクロリットルの洗浄バッファーを加えてビーズを洗浄します。
2ミリリットルのマイクロ遠心チューブでチップを遠心分離して、洗浄バッファーを除去します。次に、チップのビーズを200マイクロリットルの水で洗浄し、前述のように遠心分離機で水分を取り除きます。次に、チップに10マイクロリットルの溶出バッファーを加え、スラリーを10回上下にピペッティングしてビーズを完全に浸します。
トップキャップに穴の開いた新しい0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにチップを移し、チューブを遠心分離して、漏れたタンパク質を回収します。1.5マイクロリットルのトリプシン溶液を溶離液に加え、28度で一晩消化させます。次に、1.5マイクロリットル/25ミリグラム/ミリリットルのジチオスレイトールをサンプルに加え、90度で20分間インキュベートします。
次に、サンプルを1.5マイクロリットルの0.25モルヨードアセトアミドと室温で暗所で20分間インキュベートします。その後、3.5マイクロリットルの10%トリクロロ酢酸またはTFAを加え、サンプルを2分間ボルテックスします。サンプルを室温で14、400Gで10分間遠心分離し、SDCおよびSLSを沈殿させます。
酸性化した上清を回収して脱塩します。50マイクロリットルのバッファーBをGC脱塩チップに加えます。次に、チップをホルダーに入れ、室温で1000 Gで3分間遠心分離します。
50マイクロリットルのバッファーAをチップに加え、前述のようにチップを回転させます。次に、酸性化したサンプルをチップに追加します。ホルダー内のチップを500 Gで室温で6分間遠心分離します。
これに続いて、チップに50マイクロリットルのバッファーAを加え、室温で500Gで3分間回転させてチップを洗浄します。50マイクロリットルのバッファーBを添加し、新しいチューブで500 Gの室温で3分間遠心分離することにより、GC脱塩チップからペプチドを溶出します。その後、採取した溶離液を真空濃縮器で乾燥させます。
乾燥溶離液を30マイクロリットルの0.1%ギ酸溶液に再懸濁します。分光光度計を用いて、ペプチド混合物の紫外線吸光度を214ナノメートルで測定します。最後に、10マイクロリットルの消化サンプルを液体クロマトグラフィーサンプルバイアルに移し、ナノLC-MS/MSを使用してサンプルの1マイクログラムを分析します。
宿主細胞タンパク質のトータルイオンクロマトグラムプロファイルにより、直接消化と比較して、主要なモノクローナル抗体ペプチドのほとんどが、タンパク質濃縮と限られた消化プロトコルの組み合わせにより、減少または除去されることが明らかになりました。
