まず、1ウェルあたり25マイクロリットルのラミニンを含むポリ-D-リジンプレコート384ウェルプレートを冷蔵庫から取り出し、細胞培養フードの下でプレートを室温まで約30分間平衡化します。播種直前に、自動リキッドハンドラーまたは16チャンネルピペットを使用して、各ウェルから15マイクロリットルのコーティング溶液を吸引します。次に、ミリリットルあたり300、000ニューロンを含む50マイクロリットルの細胞溶液を各ウェルに分注します。
列 1、2、23、24 列、および行 A、B、O、P のセルを塗りつぶさないようにして、エッジの影響を最小限に抑えます。これらの未使用の井戸を80マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で満たします。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。
適切な量の完全メンテナンス培地を室温で光を避けて予熱します。希釈用の完全維持培地を使用して、試験するすべての所望濃度の1.5倍濃縮化合物溶液を調製します。自動ピペッティングシステムを使用して、ニューロン含有プレートからウェルあたり40マイクロリットルの培地を廃棄し、ウェルあたり20マイクロリットルの培地を残します。
次に、ウェルあたり1.5倍濃縮の化合物溶液を40マイクロリットル添加して、所望の最終濃度にします。所望のプロトコールに従い、健常ドナー、またはLRRK2 G2019S変異を有する中脳ドーパミン作動性ニューロンを6日間培養し、ジメチルスルホキシドまたはLRRK2キナーゼ阻害剤のいずれかで処理した。ニューロンは、核染色とα-シヌクレイン、チロシンヒドロキシラーゼ、およびMAP2に対する抗体で染色されました。
