まず、ミトコンドリアを標的としたHyPer7を発現する中期出芽酵母細胞培養液を1ミリリットル採取します。細胞を6, 000Gで30秒間遠心分離し、上清を除去し、チューブ内に10〜20マイクロリットルを残します。細胞ペレットをマイクロピペットを使用して残留培地と穏やかに混合することにより、再懸濁します。
次に、送風機または糸くずの出ないティッシュを使用してガラス顕微鏡スライドを洗浄し、1.8マイクロリットルの細胞懸濁液をスライドに加えます。最後に、気泡が発生しないように、セルを斜めにゆっくりと下げて、1.5番のガラスカバースリップで覆います。次に、スライドを顕微鏡ステージに置きます。
細胞をイメージングするには、各蛍光チャンネルで検出可能なシグナルと許容可能な分解能を確保するための取得条件を設定します。たとえば、sCMOSカメラを搭載した回転ディスク共焦点顕微鏡では、2x2ビニング、20〜40%のレーザー出力、および200〜600ミリ秒の露光を使用します。次に、画像ヒストグラムを調べます。
12ビット画像では、ピクセル値の合計ダイナミックレンジが彩度なしで少なくとも数百のグレーレベルであることを確認してください。さらに、範囲がノイズレベルより1桁高いことを確認してください。ノイズ レベルを計算するには、イメージの無細胞領域のピクセル値の標準偏差を測定します。
次に、取得間の遅延なくタイムラプス画像を収集し、イメージング条件がミトコンドリアのシグナル安定性と酸化ストレスに及ぼす影響を評価します。顕微鏡取得ソフトウェアまたは ImageJ を使用して、各蛍光チャンネルの平均ピクセル値を測定し、シグナルの安定性を確保します。実験にタイムラプスイメージングを伴わない場合は、蛍光が2回または3回のZスタックの繰り返しで安定していることを確認してください。
出芽酵母のZ間隔0.5マイクロメートル、総スタック深度6マイクロメートルの画像を取得します。Z スタックを収集する場合は、Z 間隔がデータセット内のすべての画像で同じであり、セル全体が含まれるようにします。また、透過光画像を取得して、細胞の境界を記録します。
