0日目に、1000万個の293T細胞を10%FBSを含む30ミリリットルの抗生物質不使用DMEMに15センチメートルの皿に入れてプレートします。そのような料理を合計10個用意します。翌日(1日目)に、細胞が80%コンフルエントでトランスフェクションの準備ができていることを確認します。
次に、50ミリリットルのコニカルチューブに、マイクロリットルあたり0.5マイクログラムの600マイクロリットルの包装プラスミド混合物と60マイクロリットルのプラスミドバーコードライブラリを順次加えます。別の15ミリリットルのコニカルチューブに、900マイクロリットルのトランスフェクション試薬と12ミリリットルのDMEMをボルテックスで混合します。この混合物の12.9ミリリットルをDNAミックスに加え、フリックして混ぜ合わせます。
それ以上混合せずに、室温で15分間インキュベートします。次に、293T細胞を含む各15センチメートルの皿に2.5ミリリットルのインキュベート混合物を滴下し、組織培養インキュベーターで細胞を一晩インキュベートします。3日目に、培地を0.2ミクロンのろ過ユニットに通してウイルスを回収します。
ウイルス粒子を含む濾液を15ミリリットルの円錐形チューブに分注します。さらに、ウイルス力価測定のために、クライオバイアルにろ過したウイルスの1ミリリットルアリコートを5つ調製します。レンチウイルスプールを力価評価するには、65ミリリットルの腫瘍細胞増殖培地を含む滅菌ガラスフラスコに65マイクロリットルのカチオン性ポリマーを加えます。
1ウェルあたり1ミリリットルのポリマー含有培地を11枚の6ウェル組織培養プレートにピペットで移します。次に、早期継代腫瘍細胞をトリプシン化します。好ましい方法を用いて細胞を計数した後、細胞を6ウェルプレートに移します。
48時間レンチウイルスの1ミリリットルのアリコートを冷凍庫から摂氏37度のウォーターバスで解凍します。表に従って、各ウイルスモジュールの感染を準備します。
