Preparation and In Vitro Differentiation of Mesenchymal Stem Cell-Encapsulated Hydrogels for Bone Formation

まず、ヒト間葉系幹細胞をトリプシン処理して細胞懸濁液を作成します。次に、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに分注し、10個のコンストラクトを作成します。懸濁液を220gで3分間遠心分離した後、真空ポンプを使用して上清を除去します。

次に、セルペレットを氷の上に置きます。次に、チオール変性ヒアルロン酸、チオール反応性架橋剤、ポリエチレングリコールジアクリレート、脱気したウォーターボトルを室温に戻します。無菌状態では、針付きのシリンジを使用して、ヒアルロン酸を含むボトルに1ミリリットルの脱気水を加えます。

溶液をボルテックスし、透明になるまで摂氏37度に加熱します。次に、溶液を氷の上に置きます。無菌条件下で、5ミリリットルの脱気水を架橋剤ボトルに加えます。

氷の上に置く前に繰り返し反転させて溶かします。次に、120マイクロリットルの溶解したヒアルロン酸溶液を分注した細胞ペレットに加え、溶液をピペッティングして細胞ペレットを再懸濁します。再懸濁した細胞ペレットを入れたチューブに溶解した架橋剤溶液30マイクロリットルを加えます。

チューブを叩いて、適切な混合を確保します。混合後、溶液を短時間スピンダウンします。15マイクロリットルの混合溶液をパラフィンコーティングされた24ウェルプレートに滴下します。

摂氏37度で30分間固化させます。in vitro分化のために、0.5ミリリットルの軟骨形成分化培地を細胞に座らせたハイドロゲルに添加します。3週間後、肥大分化培地に切り替え、ウェルあたり0.5ミリリットルを添加します。

軟骨形成分化により、ヒアルロン酸またはHAおよびコラーゲンコンストラクトの両方で、2型コラーゲン陽性細胞外マトリックスに硫酸化グリコサミノグリカンが生成されました。しかし、ヒアルロン酸コンストラクトでは分布がより均一でした。コラーゲンコンストラクトは、不均一な形態を持つ末梢細胞を示しました。

HAコンストラクトの細胞の平均真円度は、コラーゲンコンストラクトよりも高かった。カルシウム沈着は、5週間後に両方の構築物の外縁で検出されました。in vivo HAコンストラクトでは、すべてのインプラントが皮下ポケットに互いに取り付けられ、統合された骨組織を形成しました。

in vivoコラーゲンコンストラクトの40%は独立していました。ラメラ形態を有する骨様組織は、移植後8週間で両方のin vivoコンストラクトの外側領域に形成された。HAコンストラクトでも軟骨の喪失が観察されました。

複数のin vivo HAコンストラクトは、骨組織への接続および関節線維組織の存在によって示されるように、統合された骨組織を形成するようであった。コラーゲンコンストラクトの40%は結合していましたが、残りのコンストラクトは離れて存在しているか、骨組織の接続なしでのみ付着していました。どちらの構築物も骨髄に陽性標識血管を示し、内軟骨は多核破骨細胞に囲まれていました。

この鉱物は、鉱物量の多いコンストラクトと、サイズが大きいためにHAコンストラクトの両方の外側骨突起領域に堆積しました。