我々はそれぞれ、Sciara coprophilaとIlyanassa obsoletaに生体内の遠心分離をテストするために材料を供給するためのスーザンGerbi、ハイジスミス、およびデビッドランバートに感謝。私たちは、テクニックや原稿上のコメントのWelte氏研究室のメンバーに感謝。 生体内の遠心分離アッセイの開発と改良はMAWにNIGMS助成金GM64687によってサポートされていました。図に示されている画像。図1、図。 5E、Fは、以前は次の2を出版され、その許諾を得てここに転載されています。

<ol>
	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+Drosophila+embryos.">Quantitative microinjection of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 345-359 (2000).</li><li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes.">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li><li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior.">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li><li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos:+forces+and+kinetics.">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li><li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=unpublished+observations.">unpublished observations.</a> , .</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos.">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. , 141-157 (2000).</li><li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport:+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar.">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li><li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos.">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li><li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2.">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+XXII:+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging.">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , (1927).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females.">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

重要なステップ 寒天の濃度が十分な大きさであることを確認してください。それが低すぎる場合は、寒天は、遠心分離中に崩壊し、胚が破裂したり、ランダムに配向されます。寒天の濃度は（ステップ4.3の過剰TSSの不十分な乾燥または不十分な除去）をわずかに低すぎるまたは寒天が濡れている場合であれば、胚は、遠心分離中にそれらの穴からフロートと不適切指向になります。寒天があまりにも薄く注がれている場合、それはまた、遠心分離中に崩壊したり、割れの原因となる。 オルガネラが個々の細胞の数千の中で隔離さになるので、 胚の細胞化の段階を超えて進んでいないことを確認してください。そうしないと、細胞内小器官の分離では（図5C）は動作しません。一つの細胞の段階では若い胚では、細胞内小器官は、大きな距離を移動する自由であり、その特徴的な密度に応じて蓄積する。古すぎる胚を分析避けるために、（i）を、女性は古い卵を（ステップ2.4​​）レイアウトするために事前にコレクションを含む（ⅱ）（ⅲ）、（ステップ2.5）3時間以内のために胚を回収することを確認してください視覚的に寒天に埋め込むため細胞化ステージの前に胚を選択する（ステップ4.2）、（IV）細胞化（ステップ4.6）の最後まで開発を防ぐために、短い時間を埋め込む維持、および（v）（ステップ5.6）正しく層しなかった胚を破棄。 遠心分離の時間を出し惜しみしないでください。胚の一部も遠心分離のわずか10分後に素敵なレイヤーが表示されますが、分離は胚から胚に矛盾している。 30分のスピンは非常に一貫した結果を与える。遠心分離が終了した後も、長く遠心時間は、長く層が安定しています。これは、使用前にさらに胚を処理するのに時間がかかりますで、これらのアプリケーションにとって重要です（例えば、彼らは移植実験のために処理または共焦点分析のためにマウントする必要がある場合）。 実行可​​能な変更 卵の収集と絨毛膜の除去 、多くの異なるプロトコルのステップ2と3 1、3、9のために存在し、動作するだけでなく、ものがここで使用される胚の若者である限り説明し、卵の収率が高くなる、との割合ミス段階的な胚は最小限に抑えられます。 後端は寒天と前端に埋もれていることをすべての胚はそのような前後位置合わせのプロトコルに配向は（図3）までです。このオリエンテーションでは、それが最後の遠心分離（図1、5）中に指されるランドマークとして卵門を使用することが可能となるように、一貫性のために良いです。しかし、実際に、それは、明視野顕微鏡による脂質滴と卵黄の層の異なる外観で遠心分離胚の方向を選ぶのは簡単です。その後、どちらかの端で胚をマウントすることが可能になり、この柔軟性は、実装工程をスピードアップします。 未延伸遠心分離プロトコルの中で最も時間がかかり、技術的に困難な側面は、寒天の胚（ステップ4）を取り付けています。それは、（一回穴に挿入するには、一度遠心分離した後、それを回復する）二回各胚に触れる必要があります。別の方法として、一つはTSSで満たされたマイクロチューブにステップ4.1に胚を転送することができます。これらのチューブを遠心（13,000 rpmで、10〜30分間）で遠心分離されている場合、胚意志もよく、通常、層10-13この変化は1つが非常に迅速に、同時に胚の数百を処理することができます。しかし、階層化は、一貫していません。胚の割合は、上記のプロトコルに適用されるよりもはるかに高い遠心力（〜16,000 G）にもかかわらず、異なる層を開発していません。より挑戦的な胚の向きが可変であり、そして一つの主要な胚軸に様々な角度で分離を観察できるという事実です。このばらつきは、実験者は、特定胚を遠心管に配置されたか、遠心分離後にソートする必要があります。それは確実にそれを行うには多くの練習とより多くの判断を必要とするものの胚の中で最も密度の高い部分のためのマーカーとして、卵黄の自家蛍光を使用すると、これは、多くの場合可能です。サンプルで十分な胚がある場合は、一つは胚の図のように配置するとき、何が起こっているにそれらのインスタンスをソートすることができるかもしれません。 1。 その卵の殻の胚の遠心分離は、それは最初の2絨毛膜を除去せずに、手順4の寒天に胚を埋め込 ​​むことが可能です。このアプローチでは、コレクションプレート上胚はハロカーボンのオイルの代わりにステップ3.2（ハロカーボンは、絨毛膜の半透明に変化）で50％の漂白剤で覆われている。適切な段階の胚を選択し、ピンセットを使用して、新しい寒天プレートに転送されます。ピンセットでのみ卵のフィラメントをつかんで、損傷を胚の適切なが回避される。胚は前卵のフィラメントは、寒天の穴の外まで付着して、から4.8ステップ4.4のように埋め込まれている。胚を遠心分離し、ステップ5.4のように寒天に掘らされた後に卵の殻は、50％の漂白剤の処理により除去される。卵の殻の存在下で遠心分離する（ステップ6.2）固定後devitellinizationの速度を改善するかもしれませんが、遠心分離のための適切な段階での選択（ステップ4.2）より困難です。 アプリケーション胚の遠心分離は、特定のタンパク質が特定の主要な細胞小器官に局在するかどうかをテストするために、すなわち、局在の実験のために特に有用である。例えば、クラータンパク質が初期胚脂質滴上に存在する、まだこの局在は、無傷の胚で実証するために困難である。クラー涙点と脂肪滴の両方が除外するのは難しいスプリアス共局在を作り、胚の周辺部10に豊富に存在するので、一部では、これは。しかしながら、遠心分離は、異なる層に脂肪滴を集中し、従って、クラー信号と共局在は10明らかになる。 同様の分析は、明確に特定のヒストンのような驚くべき例を含む脂肪滴8、13-15、2とタンパク質が遍在存在する場合には他のタンパク質の局在を示したが脂肪滴8に富んでいる。胚が発達段階（ステップ4.2）で視覚的に選択できるように、それは脂肪滴8、15に蛋白質の分化段階募集を検出することも可能です。脂肪滴は、視覚的に明確な&quot;キャップ&quot;に蓄積するので、脂肪滴と共局在するためのテストは特に簡単ですが、それ以上のマーカーまたは染色がこの層を識別するために必要ありません。実際には、理由その使いやすさと潜在的に印象的なビジュアルの結果（図1、図5、D、E）から、私たちの研究室では、候補タンパク質が脂肪滴に局在しているかどうか最初のテストとして、現在日常的にこの手法を採用しています。原則として、同様の共局在の研究は、図に示すように、他の小器官のために働く必要があります。その分布遠心分離胚の文書化が完了していない他の人のための可能性1、（細胞内寄生体を含む）。 遠心分離は、タイトなバンドに小器官を絞っているので、それはこれらの細胞小器官に富む画分の分離を容易にします。このアプローチはすでにドナー胚2に移植のために脂肪滴を回復するために使用されています。また、生化学的に濃縮画分（例えば、固定15日以降の胚からの層を切断することによって）分析することが可能であるかもしれません。 方法は、遠心分離は多くの異なる種の卵（カエル、線虫、ホヤ、環形動物、ウニ、貝類、そして刺胞動物を含む）16を層別化するために使用できるように、 ショウジョウバエの胚を超えてアプリケーションを持ってここで説明する。我々自身の研究室では、イエバエイエバエ 2の胚については、上記のプロトコルを使用しているとキノコバエSciara coprophila 17とカタツムリIlyanassa obsoleta 17日から胚の解析で未延伸遠心分離を用いている。最後に、この方法は、胚に限定されるものではありません。遠心はまた、卵母細胞（例えば、 ショウジョウバエ 2、18、トウワタバグOncopeltusアカハタ 17）などの巨大な細胞を、層別化すると便利です。異なる試料の場合は、正確な遠心分離の条件は、最適化する必要があります：例えば、3000gで10分、効率的にイエバエ 2の胚を層別化するのに十分である、とはるかに長い間遠心分離した場合、胚は、固定および免疫染色時にバラバラにする傾向がある。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

細胞内小器官の様々なタイプを精製し、単離するための主要な戦略は、浮遊密度の差に基づいて、お互いからそれらを分離することです。しかし、細胞を前に遠心分離に中断されている場合、この非ネイティブ環境でのタンパク質や細胞小器官は、しばしば不適切にお互いに固執する。ここではそのまま、生きてショウジョウバエの胚で密度によって細胞小器官を分離する方法を説明します。細胞化前の初期胚は、人口のケージから収穫され、その外側の卵の殻は、50％の漂白剤の処理により除去されています。胚はその後、寒天に小さな縦の穴に、最初に小さな寒天プレートと挿入、後端に転送されます。埋め込まれた胚を含むプレートは3000グラムで30分間遠心分離されています。寒天は、胚をサポートしており、定義された方向でそれらを保持します。その後、胚を鈍針で寒天に掘られている。 遠心分離は、明視野顕微鏡による階層化が容易に目に見える、別個の層に主要な細胞内小器官を分離する。蛍光マーカーの数は、生きた胚で成功した成層を確認するために用意されています。特定のオルガネラに関連するタンパク質が共局在を示す、特定の層に濃縮されます。個々の層は、提供された卵子に生化学的解析や移植のために回収することができます。この技法は、多様な種の卵や卵母細胞を含む他の大規模な細胞、内オルガネラの分離に適用可能です。

Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos at JoVE.com

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

我々は生体内での密度によって細胞小器官を分離する方法を説明します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚。胚を寒天に埋め込まれ、遠心分離されています。この手法は、前後の胚軸に沿って主要な細胞小器官の再現可能な分離が得られます。このメソッドは、生化学的解析と移植の実験のために共局在の実験と収量オルガネラの分画を容易にします。

ショウジョウバエの胚の生体内の遠心

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

18.3K ビュー.  University of Rochester. 我々は生体内での密度によって細胞小器官を分離する方法を説明しますショウジョウバエ胚。胚を寒天に埋め込まれ、遠心分離されています。この手法は、前後の胚軸に沿って主要な細胞小器官の再現可能な分離が得られます。このメソッドは、生化学的解析と移植の実験のために共局在の実験と収量オルガネラの分画を容易にします。